Биолюминесценция аденозинтрифосфата (АТФ)

Небиологический синтез АТФ во внеклеточной среде известен [104], но общепризна­но, что такие источники АТФ очень редки [62].

АТФ — это высокоэнергетическое вещество, обнаруживаемое во всех живых клетках [104], и необходимый компонент на начальных биохимических этапах использования субстрата, а также в синтезе клеточ­ного материала.

В работе [84] впервые было показано, что испускание света в реакции биолюминес­ценции РкойптругаИэ [светляка (летающего)] стимулируется АТФ. Методика опре­деления концентраций АТФ с использованием необработанных экстрактов светляков описана в работе [84], и с тех пор она использована во многих областях в качестве чувствительного и точного метод измерения АТФ. Катализатором реакции, сопро­вождаемой излучением света, служит фермент люцифераза, обнаруживаемый в све­тящихся жуках-светляках. Люцифераза принимает участие в следующей реакции:1.1

Реакция, сопровождающаяся испусканием света, эффективна; окисление каждой молекулы люцеферина сопровождается испусканием одного фотона и, таким образом, используется каждая молекула АТФ [112].

В работе [78] впервые было описано использование количественного определения АТФ на основе биолюминесценции светляков для обнаружения присутствия жизне­способных микроорганизмов. После появления этого первого отчета с помощью метода биолюминесценции выполнен большой объем работ по определению жизнеспособных микроорганизмов в пробах окружающей среды [118]. Поскольку все жизнеспособные микроорганизмы содержат АТФ, можно считать, что метод биолюминесценции доста­точно просто использовать для быстрого определения численности микроорганизмов. Исследования, однако, показали, что количество АТФ в различных микробных клет­ках разное в зависимости от вида, обеспечения питанием, отрицательных воздействий и стадии роста [118,119]. Поэтому при использовании биолюминесценции важно учи­тывать следующее:

  •  тип определяемого микроорганизма (обычно вегетативные бактерии содержат по 1 фемтограмму (фг) АТФ на клетку [72], дрожжи содержат его в десять раз больше [ 118], а споры вообще не содержат АТФ [ 113]);
  •  подвергались ли клетки отрицательному воздействию (например, истощению питательных веществ, охлаждению или изменению pH); в таких случаях перед тестированием может потребоваться короткое восстановление;
  •  находятся ли клетки в среде, в которой относительно мало АТФ (такой, как среда для выращивания), или в сложной матрице (такой, как пищевой продукт) с очень высоким фоновым содержанием АТФ.

При тестировании проб пищевых продуктов одна из самых больших проблем — это последний из вышеуказанных пунктов. Все продукты содержат АТФ, и его содержание обычно значительно выше его содержания в микроорганизмах, обнаруживаемых в этих продуктах. Данные [113] показывают, что соотношение АТФ продуктов к АТФ бакте­рий варьирует от 40 ООО : 1 (в мороженом) до 15 : 1 (в молоке). Поэтому, чтобы ис­пользовать определение АТФ в качестве экспресс-теста для определения микроорга­низмов в пищевых продуктах, были разработаны методы отделений микробной АТФ. Были изучены методы двух типов: физическое отделение микроорганизмов от других источников АТФ и использование специфических экстрагирующих веществ для уда­ления и разрушения немикробной АТФ. Методы фильтрации были успешно примене­ны для выделения микроорганизмов из напитков [77,79] и проб пивоваренного про­изводства [65]. Эти методы, однако, сложно применить к растворам, содержащим макрочастицы, так как фильтры быстро засоряются. Возможный способ решить эту проблему основан на применении схемы двукратной фильтрации [80], в которой пер­вый фильтр удаляет остатки пищевого продукта, но пропускает микроорганизмы, а второй фильтр задерживает микроорганизмы перед лизисом и биолюминесцентным анализом. Другие исследователи [8,120] для избирательного отделения остатков про­дукта или микроорганизмов перед биолюминесцентными тестами применяли ионооб­менные смолы.

В результате тщательных исследований избирательной химической экстракции была показана возможность успешного применения ее для отделения микробного и немикробного АТФ для молока [25] и мяса [18]. Обычно в этом методе используется лизис соматических (пищевых) клеток с последующим разрушением выделенного АТФ ферментом (апиразой). Затем можно применить более сильный экстрагент для разложения микробных клеток, и далее — тестирование с помощью люциферазы. Та­кой метод позволяет определять только микробный АТФ.

Выпускается ряд приборов, предназначенных специально для определения микроб­ного АТФ. Фирмы Lumac (Нидерланды), Foss Electric (Дания), Bio Orbit (Финляндия) и Biotrace (Великобритания) производят системы, использующие методы разделения, специально разработанные для определения микроорганизмов в пищевых продуктах. Обычно эти системы работают хорошо и имеют сходные характеристики, включая минимальный порог определения 104 бактерий (103 клеток дрожжей) и время анализа менее 1ч.

Кроме определения в пищевых пробах общего количества жизнеспособных микро­организмов, имеется ряд сообщений относительно возможных применений АТФ-биолюминесценции в пищевой промышленности. Применение АТФ-анализа к экспресс­ному определению в санитарии рассмотрено в работе [59] как метод быстрой оценки микробиологического заражения и как метод измерения общей чистоты поверхно­стей. Именно во втором случае АТФ-измерение может дать уникальный результат. Как отмечалось выше, почти все пищевые продукты содержат АТФ в больших количе­ствах, поэтому с помощью биолюминесцентного метода, позволяющего очень быстро выполнять проверку санитарно-гигиенического состояния, остатки пищевых продук­тов на технологической линии можно обнаружить в течение нескольких минут. АТФ- биолюминесценция для контроля гигиенического состояния поверхностей в настоящее время широко применяется в промышленности. Доступность относительно недорогих, портативных и простых в использовании люминометров позволяет многим произво­дителям пищевых продуктов внедрять методы экспресс-тестирования гигиенического состяния, идеальные для контроля в рамках системы НАССР, где гигиеническое состо­яние поверхности — это критическая контрольная точка. Данные [51] свидетель­ствуют, что на всех обследованных предприятиях, регулярно применяющих методы гигиенического АТФ-контроля, после внедрения этих методов отмечено улучшение санитарно-гигиенического состояния. Такие системы контроля на основе определения АТФ могут применяться на большинстве пищевых технологических установок, в орга­низациях общественного питания и в розничной торговле, а также для оценки санитар­но-гигиенического состояния транспортных средств (например, автоцистерн).

Одной из задач, с которой пока АТФ-биолюминесценция справиться не может, — это определение конкретных микроорганизмов. Можно использовать избирательную среду выращивания для определенных микроорганизмов при их избирательном выра­щивании перед АТФ-анализом. Такой подход может, однако, значительно увеличить продолжтельность анализа, в связи с чем можно ожидать ошибочно высоких результа­тов. Возможность успешного использования избирательных лизогенных факторов, высвобождающих АТФ только из определяемых клеток, показана в исследовании, описанном в работе [119]. Набор таких специфических веществ довольно мал, и поэто­му метод может иметь ограниченное применение. Возможно, наиболее перспективным методом, разработанным для определения отдельных микроорганизмов, является при­менение бактериофагов, полученных с помощью генной инженерии [111,126,127].

Бактериофаги — это вирусы, заражающие бактерии. Изучение бактериофагов по­казало, что некоторые из них весьма избирательны и заражают только определенные виды бактерий. Тем самым можно вводить в бактериофаги генетическую информа­цию, вызывающую производство бактериальной люциферазы. Таким образом, когда бактериофаг заражает определенную бактерию-«хозяина», она производит люциферазу и начинает люминесцировать. Этот метод требует тщательного выбора бактериофа­га для исключения ошибочных положительных или отрицательных результатов, однако исследования показывают, что в будущем методы, основанные на люминесценции, мо­гут быть использованы для экспресс-определения конкретных микроорганизмов [124].

В заключение можно отметить, что использование АТФ-биолюминесценции в пи­щевой промышленности уже развито до такого состояния, при котором она может быть надежно использоваться для экспресс-определения жизнеспособных микроорга­низмов (если применяется эффективный метод отделения для микробной АТФ). По­тенциальная возможность использования этого метода в экспресс-анализах гигиени­ческого состояния в настоящее время общепризнана. Исследования также показали, что люминесценция делает возможным экспресс-определение конкретных микроорга­низмов, но такая система перед ее широким применением в пищевой промышленности должна быть хорошо отработана.

Методы микроскопии

Микроскопия — это признанный и несложный метод определения количества микро­организмов. Одно из первых описаний ее использования относится к быстрому под­счету бактерий в пленках молока, окрашенных метиленовым синим [26]. Одно из ос­новных достоинств микроскопических методов — скорость, с которой могут быть выполнены отдельные анализы; однако следует учесть большой объем ручной работы и возможность усталости оператора, вызванной непрерывным подсчетом.

Использование флюоресцентных красителей вместо традиционных окрашенных со­единений позволяет упростить подсчет, в связи с чем такие красители стали объек­том многих исследований. Микробиологи-экологи сначала использовали такие со­единения, чтобы сделать видимыми микроорганизмы в природной воде и подсчитать их [50, 67]. Использование поликарбонатных мембранных фильтров из нуклепора (nuclepore) для отделения микроорганизмов перед флуоресцентным окрашиванием впервые описано в работе [58]. Подсчет детально рассмотрен в работе [ 100], и разрабо­танный авторами метод известен как метод прямой эпифлуоресцентной фильтрации (direct epifluorescent filter technique, DEFT).

Метод DEFT — это трудоемкий ручной метод, что дало толчок исследованиям в области автоматизированных флюоресцентных микроскопических методов (с авто­матической пробоподготовкой и высокой производительностью). Первым полностью автоматизированным прибором, основанным на флюоресцентной микроскопии, был Bactoscan (фирмы Foss Electric, Дания), который был разработан для подсчета бакте­рий в молоке и моче. Пробы молока, помещенные в прибор, подвергаются химической обработке для разложения соматических клеток и растворения казеиновых мицелл. Затем бактерии отделяются с помощью непрерывного центрифугирования до градиен­та декстрана/сахарозы. Затем микроорганизмы выращивали с протеазой для удаления остаточного белка, после чего их окрашивали акридином оранжевым и наносили в виде тонкой пленки на вращающийся под микроскопом диск. Люминесцентное излу­чение от изображения в микроскопе превращается в электрические импульсы и запи­сывается. Bactoscan широко применяется для проверок сырого молока в континен­тальной Европе и дает хорошую корреляцию результатов с данными, полученными традиционными методами [71]. Метод, однако, имеет низкую чувствительность (при­мерно 5 х 104 клеток на мл), что препятствует его использованию для проб с малым количеством бактерий.

Для пищевой промышленности был разработан инструментальный флюоресцент­ный метод подсчета, в котором пробы наносились на тонкую пластиковую ленту. При­бор Autotrak наносил пробы на ленту, которая пропускалась через окрашивающий и промывной растворы, а затем проходила перед флюоресцентным микроскопом. Све­товые импульсы от окрашенных микроорганизмов затем подсчитывались фотоумно­жителем. Анализ проб пищевых продуктов с помощью этого прибора показал [13], что пищевые остатки проб мешали окрашиванию и подсчету, а результаты оказались зна­чительно выше полученных путем подсчета общего количества жизнеспособных мик­роорганизмов.

Вероятно, самый новый метод флюоресцентной микроскопии, примененный в пи­щевой промышленности для экспресс-подсчета, — это проточная цитометрия. Окра­шенная проба пропускается под флюоресцентным микроскопом в виде жидкости в проточной ячейке. Световые импульсы, вызванные попаданием света на окрашенные частицы, поступают на фотоумножитель и подсчитываются. Этот автоматизирован­ный экспресс-метод потенциально является очень гибким. Из рассмотренных выше методов микроскопии, вероятно, наиболее широко применяется DEFT, а проточная цитометрия весьма перспективна. Ниже мы их рассмотрим подробнее.

Метод DEFT

Метод DEFT был разработан для экспресс-подсчета количества бактерий в пробах сы­рого молока [99,100]. Метод основан на предварительной обработке пробы молока в присутствии протеолитического фермента и поверхностно-активного вещества при 50 °С с последующей мембранной фильтрацией, отделяющей микроорганизмы. Пред­варительная обработка служит для разложения соматических клеток и растворимых жиров, которые могли бы заблокировать мембранный фильтр. После фильтрования мембрану окрашивают флюоресцентным красителем, связывающим нуклеиновую кислоту, акридином оранжевым, затем промывают и помещают на предметное стекло. После этого мембрану рассматривают через эпифлуоресцентный микроскоп, который освещает мембрану ультрафиолетовым светом (при этом краситель испускает види­мый свет, который можно наблюдать через микроскоп). Поскольку краситель связы­вается с нуклеиновыми кислотами, он концентрируется в клетках микроорганизмов, связываясь с молекулами ДНК и РНК; таким образом, любой микроорганизм на мем­бране можно легко увидеть и подсчитать. Полную предварительную обработку и под­счет можно выполнить всего за 30 мин.

Хотя метод DЕFТ позволял осуществить подсчет очень быстро, он был очень трудо­емким, поскольку вся предварительная обработка и подсчет выполнялись вручную, и поэтому производительность этого метода была очень мала. Разработка полуавтома­тических методов подсчета на основе анализа изображений [99] позволила преодолеть некоторые проблемы ручного подсчета и тем самым сделала метод более удобным для пользователя.

За работой по использованию DEFT для подсчета клеток в сыром молоке последо­вал анализ других видов продуктов. Вскоре было установлено, что хорошая корреляция между результатами DEFT и традиционно полученным общим числом жизнеспо­собных микроорганизмов в пробах сырого молока, отсутствует при анализе молока, прошедшего тепловую обработку [98]. Первоначально полагали, что это связано с из­менениями грамположительных кокков при термоиндикаторном окрашивании [98], однако позже было показано [3], что подобные изменения происходят как в грамполо­жительных, так и в грамотрицательных микроорганизмах. Схожие явления при окра­шивании также наблюдались в случае тепловой обработки дрожжей [106] и в облучен­ных пищевых продуктах [14], в связи с чем применение DEFT в качестве метода быстрого определения общего количества жизнеспособных микроорганизмов ограни­чено в основном сырыми продуктами.

Перечень типов продуктов, для которых может использоваться метод DEFT, в на­стоящее время расширился. В литературе описано применение этого метода для замо­роженного мяса и овощей [108], сырого мяса [114], алкогольных напитков [33, 115], томатной пасты [101], кондитерских изделий [96], обезвоженных пищевых продуктов [92] и санитарно-гигиенического контроля [60]. Кроме того, некоторые исследователи [107] писали о возможной модификации метода для выявления и подсчета определен­ных групп микроорганизмов.

В заключение отметим, что DEFT— это очень быстрый метод подсчета общего ко­личества жизнеспособных микроорганизмов в сырых продуктах, успешно применя­емый в промышленности. К его недостаткам относятся отсутствие избирательности и неспособность дать точную оценку количества жизнеспособных микроорганизмов в обработанных пищевых продуктах. Первая проблема может быть решена путем приме­нения коротких стадий избирательного роста или антител с флюоресцентным мечением, но подобные решения требуют затрат времени и денег. Проблема обработанных продуктов может быть решена только путем исследований других систем окрашива­ния, маркирующих жизнеспособные клетки; в работе [15] показана плодотворность такого подхода и перспективность метода при выпуске и внедрении флюоресцентных красителей для жизнеспособных микроорганизмов. Тем не менее в настоящее время большая трудоемкость и низкая производительность метода DEFT ограничивает его применение в пищевой промышленности.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — это метод, основанный на экспресс-измерении клеток при их прохождении в потоке жидкости мимо точки считывания [28]. Исследуемые клетки вводят в центр потока жидкости (жидкости-носителя). Это заставляет их проходить по одной мимо датчика и делает возможным регистрацию каждой частицы, а не полу­чение усредненных значений для всей популяции. В точке считывания имеется пучок света (ультрафиолетового или лазерного), нацеленный на контролируемый поток, и один или несколько детекторов, измеряющих рассеяние света или флюоресценцию при прохождении частиц под пучком света. Расширение применения проточной цито­метрии в исследовательских лабораториях в основном обусловлено разработкой на­дежных приборов и многочисленных систем окрашивания. Красители, которые могут быть использованы с приборами для проточной цитометрии, позволяют выполнять самые разнообразные измерения. Исследованы флюоресцентные датчики, основанные на активности ферментов, на содержании нуклеиновых кислот, мембранного потен­циала и pH; использование же флюоресцентных красителей, соединенных с антитела­ми, придает системе избирательность.

Проточные цитометры использовались для изучения ряда эукариотических и про­кариотических организмов. Работа с эукариотами включала исследование патогенной амебы [89] и культуры дрожжей [64], а исследования бактерий включали исследова­ние роста Escherichia coli [122], подсчет клеток бактериальных культур [103] и опреде­ление разновидностей Legionella в воде градирен [125].

Методы проточной цитометрии для пищевой промышленности освещаются в [130]. В работе [41] исследовалось использование антител, меченых флюоресцентными ве­ществами, для определения Listeria monocytogenes в молоке, причем были получены обнадеживающие результаты. Использованный в данной работе метод основан на се­лективном выращивании организмов в течение суток и последующем окрашивании их поливалентными антителами Listeria, меченными флюоресцеиновым изотиоциа- натом. Затем окрашенные клетки пропускали через проточный цитометр и определяли L. monocytogens. Было высказано предположение, что эта система может быть исполь­зована и с другими видами продуктов. Подобный подход использовали также в работе [82] для определения Salmonella typhimurium в молочных продуктах.

В [94] исследовалось применение проточного цитометра  Argus  для подсчета бактерий в чистых культурах и пищевых продуктах. Результаты, полученные с чисты­ми культурами, показали хорошую корреляцию подсчетов, полученных на проточном цитометре, с подсчетами на пластинках до концентраций 103 клеток на грамм, но для пищевых продуктов были получены противоречивые результаты. Применение этого метода для проб мяса дало хорошее совпадение с подсчетами на пластинках и позволи­ло проводить подсчет до 105 клеток на грамм. Результаты для молока и паштета были хуже, причем чувствительность системы для паштета составляла 106 клеток на 1 мл, а клетки, введенные в молоко, не обнаруживались на уровне более 107 на 1 мл. Низкая чувствительность этого проточного цитометра при измерениях на продуктах была от­несена за счет влияния системы подсчета, вызванного пищевыми остатками; авторами было высказано предположение, что решить эту проблему можно, применив методы разделения клеток микроорганизмов и пищевых остатков.

Наиболее успешно методы проточной цитометрии применяются для пищевых про­дуктов при использовании системы Chemunex ChemflowRjin обнаружения загрязняю­щих дрожжей в молочных и фруктовых продуктах [6]. Методика, используемая при работе с этой системой, требует инкубации продукта в течение 16-20 ч с последую­щим центрифугированием для отделения и концентрирования клеток. Затем добавля­ется краситель, и проба пропускается через проточный цитометр для анализа. Оценка системы [97] на примере безалкогольных напитков, заквашенных дрожжами, показала, что она надежна и удобна в работе. Данные цитометра хорошо совпадали с данными метода DEFT, однако автор не привел результатов сравнения данных системы с резуль­татами подсчетов на пластинках.

В исследованиях системы Chemflow, описанных в работе [6], использовались раз­личные молочные и фруктовые продукты, заквашенные дрожжами. Результаты свиде­тельствовали, что дрожжи могли быть обнаружены в молочных продуктах через сутки при наличии лишь 1 клетки на 25 грамм. Во фруктовых соках была также получена аналогичная чувствительность, но для ее достижения требовалось уже 48 ч. Система показала свою надежность и удобство в работе и в настоящее время адаптирована для обнаружения как дрожжей, так и бактериальных клеток; существуют также варианты ее применения для биомассы ферментера и подсчета общей микрофлоры в овощах. Система Chemflow прошла полные испытания в условиях производства при анализе кисломолочных продуктов [43]. Авторы этой работы указывают на очень хорошее со­ответствие результатов подсчета на цитометре и на пластинке (г = 0,98), причем ре­зультаты получаются через 24 ч, что означает экономию трех суток по сравнению с классическими методами.

В заключение отметим, что проточная цитометрия может обеспечить быстрый и чувствительный метод быстрого подсчета микроорганизмов. Успешная работа систе­мы зависит от разработки и применения

а) соответствующих систем окрашивания и

б) процедур отделения микроорганизмов от остатков пищевых продуктов, которые в противном случае мешают работе системы определения. В будущем проточный цито­метр, снабженный рядом систем фотодатчиков, мог бы позволить проводить анализ проб одновременно по многим параметрам, значительно упрощая режимы тестирования.

Твердофазная цитометрия

Относительно новый вариант цитометрии разработан компанией Chemunex (r. Мезон- Альфор, Франция) на основе твердофазной цитометрии. В этом варианте пробы про­ходят через мембранный фильтр, который задерживает заражающие микроорганиз­мы. Затем, чтобы пометить метаболически активные клетки микроорганизмов, на фильтр наносится флюоресцентный краситель. После окрашивания мембрану перено­сят в прибор Chemscan RDI, который сканирует всю мембрану с помощью лазера, под­считывая флюоресцирующие клетки. Выполнение процедуры занимает около 90 мин и позволяет определять отдельные клетки в пробе на фильтре. Система для твердо­фазной цитометрии Chemscan RDI— это мощный инструмент для быстрого подсчета малых количеств микроорганизмов. Она идеально пригодна для анализа воды или других чистых фильтрующихся жидкостей, а применение специфических методов мечения может быть использовано для избирательного выявления определенных мик­роорганизмов. Пищевые продукты с крупными частицами могут, однако, мешать ана­лизу, так как микроорганизмы перед фильтрованием и анализом должны быть отделе­ны от пищевого материала.

Иммунологические методы. Антитела и антигены

Иммунологические методы основаны на реакции специфического связывания, кото­рая протекает между антителом и соответствующим антигеном. Антитела — это белко­вые молекулы, которые производятся лейкоцитами в ответ на контакт с веществом, вызывающим иммунную реакцию. Область, к которой антитело прикрепляется на мо­лекуле, известно как антиген. Антигены, используемые в иммунохимических методах, бывают двух типов: первый возникает, когда определяемое вещество имеет низкий мо­лекулярный вес и само поэтому не стимулирует иммунную реакцию — такие вещества называют гаптенами (неполноценными антигенами), и они, чтобы вызвать иммунную реакцию и образование антител, должны быть связаны с более крупной молекулой- носителем. Второй тип антигена является иммуногенным и может сам вызвать иммун­ную реакцию.

В иммунологических тестах могут применяться два типа антител: моноклональные и поликлональные антитела. Поликлональные антитела образуются при использовании для стимуляции иммунной реакции больших молекул (таких, как белки или целые бактериальные клетки). Наличие большого количества антигенных участков приво­дит к образованию множества различных антител в качестве реакции на молекулу или клетку. Моноклональные антитела образуются с помощью культур клеток ткани от од­ного лейкоцита; это означает, что они нацелены на один антигенный участок. Связыва­ние антигена очень специфично, и поэтому иммунологические методы могут исполь­зоваться для обнаружения определенных микроорганизмов или белков (например, токсинов). Во многих случаях при использовании этих методов к антителу прикреп­ляется метка, чтобы при связывании оно было легко заметно.

Метки

С антителами могут быть использованы метки многих типов, включая радиоактивные метки, флюоресцирующие вещества, светящиеся вещества и ферменты; кроме того, для обнаружения связывания антитела с антигеном могут использоваться реакции аг­глютинации.

Радиоизотопы широко применяются как метки в основном из-за высокой чувстви­тельности, которой можно достигнуть с их помощью. Тем не менее они обладают неко­торыми недостатками, основным из которых является потенциальная опасность реа­гентов. Это препятствует их применению где-либо, кроме специальных лабораторий, и естественно, возможность их использование в пищевой промышленности вызывает большие сомнения.

Флюоресцентные метки широко применяются для изучения микроорганизмов. Наиболее часто используемый реагент — это флюоресцеин, но используются и другие, например, родамин и умбеллиферон. Самый простой случай использования флюорес­центных антител — это микроскопия. Последние достижения в этой области — приме­нение проточной цитометрии для многопараметрического проточного анализа окра­шенных препаратов и разработка иммунофлюоресцентного метода анализа с помощью иммобилизованного фермента (ЕLIFА), причем некоторые методы были автоматизи­рованы.

Светящиеся (люминесцентные) метки исследовались как альтернатива потенци­ально опасным радиоактивным [75]. Метки могут быть как хемилюминесцентными, так и биолюминесцентными, и их достоинством по сравнению с радиоактивными яв­ляется простота использования и измерений, выполнимых на простом оборудовании при аналогичной чувствительности [109]. В ряде исследовательских работ успешно использовался иммунолюминометрический анализ [81], но свидетельств его внедре­ния в производство пока нет.

Антитела используют для определения антигенов в реакциях осаждения и агглюти­нации. Такие анализы выполнить количественно обычно труднее, чем другие виды им­мунологического анализа, и поэтому они используются для качественной оценки. Ана­лизы проводятся просто и быстро, требуя минимального аппаратурного оснащения.

Ряд реакций осаждения уже успешно внедрен в пищевую промышленность. Эти методы использовали в основном для подтверждения тождества микроорганизмов, а не для определения заданных микроорганизмов. Время анализа с помощью этих ме­тодов относительно невелико, их просто использовать и обычно они не требуют специ­ального оборудования, что делает их идеальными для лабораторий, выполняющих стан­дартные испытания.

Выпускается несколько комплектов для латексных агглютинационных проб для оп­ределения Salmonella в пищевых продуктах. Среди них Oxoid Salmonella Latex Kit (Oxoid), созданный для использования с тестовым комплектом Oxoid Rapid Salmonella Test Kit [61]; комплект Micro Screen Salmonella Latex Slide Agglutination Test (Mercia Diagnostics Ltd.); комплект Wellcolex Colour Salmonella Test ( Wellcome Diagnostics) [53,54] и Spectate Salmonella test (Rhone Poulenc Diagnostics Ltd.) [29]. В последних двух комплектах ис­пользуются смеси окрашенных латексных частиц, которые позволяют не только опре­делять, но и выявлять серологические группы Salmonella. Комплекты для латексных агглютинационных проб также выпускаются для Campylobacter (Microscreen, Mercia Diagnostics), Staphyloccocus aureus (Staphaurex, Wellcome Diagnostics), Shigella ( Wellcolex Colour Shigella Test, Wellcome Diagnostics) и Escherichia coli 0157:#7 {Oxoid). Агглютина- ционные пробы также разработаны для определения микробных токсинов, например, проба Oxoid Staphylococcal Enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination Test [5,110].

Ферментный иммунологический анализ широко исследовался в качестве метода для экспресс-определений пищевых микроорганизмов. Достоинством такого анализа явля­ется его специфичность, достигаемая за счет использования специфических антител в сочетании с цветными или флюоресцентными конечными точками, которые легко обна­ружить визуально или с помощью спектрофотометра. Большинство серийно выпускае­мых комплектов для иммунологического анализа используют метод «сэндвичей» из антител, чтобы сначала захватить, а затем определить специфические микробные клетки или токсины. Комплекты поставляются с двумя видами антител: иммобилизованными и конъюгированными. Иммобилизованное антитело прикреплено к твердой подложке, например, к микротитровальной пластинке-ячейке. Обогащенная пищевая проба может быть добавлена в ячейку, и антигены из любой присутствующей определяемой клетки связываются с антителами. Ячейку промывают, удаляя пищевые остатки и несвязан­ные микроорганизмы. Затем в ячейку могут быть добавлены конъюгированные с фер­ментом антитела. Они связываются с определяемыми клетками, образуя «сэндвич» из антител. Несвязанные антитела можно затем вымыть из ячейки и добавить ферментный субстрат. Любой присутствующий фермент превращает бесцветный субстрат в окра­шенный продукт. Выполнение типичного ферментного иммунологического анализа на микропластинке занимает 2-3 ч и показывает присутствие предполагаемых бактериаль­ных клеток. Результаты анализа проб, показывающие положительный результат, должны всегда подтверждаться биохимически или серологически.

Выпускается ряд комплектов для ферментного иммунологического анализа, по­зволяющих определять в пищевых пробах Listeria, Salmonella, Escherichia coli 0157, Staphylococcal enterotoxins и токсин Bacillus diarrhoeal. Чувствительность этих систем составляет примерно 106 клеток/мл, поэтому перед анализом должна применяться со­ответствующая процедура обогащения пробы. Таким образом, результаты могут быть получены через 2-3 суток, а не через 3-5, как при традиционных тестах.

В последние годы был разработан ряд автоматизированных вариантов иммуноло­гического анализа, что делает этот ускоренный метод еще менее трудоемким. Автома­тизация ферментного иммунологического анализа выполняется по-разному — ряд про­изводителей продают приборы, которые просто автоматизируют стандартные методы ELIS А (твердофазного иммуносорбентного анализа) на микропластинке. Эти прибо­ры содержат емкости с реагентами и используют роботизированную автоматическую пипетку, которая подает различные необходимые реагенты в правильной последова­тельности. Автоматизацию анализа завершает автоматическая промывка и считыва­ние, снижая его трудоемкость. Существуют по меньшей мере две фирмы-изготови­теля, выпускающие оригинальные системы с комплектами для иммунологического анализа на автоматизированном приборе.

В системе Vidas (bioMerieux, г. Бэйзингсток, Великобритания) используется тесто­вая полоска, содержащая все реагенты, необходимые для ELIS А. Первая лунка полоски инокулируется обогащенной пищевой пробой и помещается в прибор Vidas вместе с кончиком пипетки, покрытым изнутри иммобилизованным антителом. Прибор затем с помощью кончика пипетки перемещает анализируемую пробу в другие ячейки полоски с различными реагентами, необходимыми для выполнения анализа. Все перемещения полностью автоматизированы, как и получение конечных результатов теста. Анализ ме­тодом ELISA на приборе Vidas может выполняться для различных микроорганизмов, включая Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E. coli 0157, Campylobacter и стафи­лококковый энтеротоксин. По результатам сопоставления [20,22] было отмечено, что по результатам этот автоматизированный анализ, по крайней мере, эквивалентен тра­диционным методам испытаний.

Система EIAFOSS (Foss Electiic, Дания) представляет собой полностью автомати­зированную система для твердофазного иммуносорбентного анализа. В этой системе все реагенты автоматически переносятся в пробирки с пробами, в которых происходят все реакции. В приборе EIAFOSS реализована оригинальная процедура, использующая магнитные бусины, покрытые антителами в качестве твердой фазы. В ходе анализа эти бусины иммобилизуются с помощью магнита, установленного под пробиркой с про­бой. Комплекты для анализа с помощью прибора EIAFOSS выпускаются для Salmonella, Listeria, E.coli 0157 и Campylobacter, при этом исследования подтердили хорошую их работу [68].

Новейшая внедренная в промышленность версия иммунологического анализа яв­ляется едва ли не самой простой. Иммунохроматография работает с помощью щупа, состоящего из наполнителя-абсорбента, который содержит цветные частицы, покры­тые антителами для определенного микроорганизма. Частицы находятся на нижней части щупа, и когда его опускают в бульон для микробиологического обогащения, они двигаются вверх по наполнителю (жидкость движется под действием капиллярных сил). В определенной точке наполнителя расположен ряд иммобилизованных специ­фических антител. При наличии определяемого микроорганизма происходит его свя­зывание с цветными частицами. Этот конъюгат клеток и частиц движется вверх по щупу под действием капиллярных сил до тех пор, пока не встречается с иммобилизо­ванными антителами, к которым он «приклеивается». Накопившиеся цветные части­цы образуют явно видимую цветную линию, указывающую на положительный резуль­тат теста.

На этой процедуре основан ряд коммерческих комплектов, в том числе Oxoid Listeria Rapid Test [69] и Celsis Lumac Pathstik [70], которые продемонстрировали хоро­шие результаты. Методы иммунохроматографии, как и другие методы иммунологи­ческого анализа, требуют обогащения, но для них не нужны особые приборы или обо­рудование, и после контакта щупа с пробой требуется лишь несколько минут, чтобы увидеть положительный или отрицательный результат.

Краткие выводы

Иммунологические методы уже всесторонне изучены и внедрены. В настоящее время имеется ряд систем, делающих возможным экспресс-определение специфических микроорганизмов, для которых они предназначены. Многочисленные испытания про­мышленно освоенных приборов для иммунологического анализа показали, что их ре­зультаты в основном хорошо соответствуют полученным традиционными микробио­логическими методами. В частности, ферментный иммунологический анализ пред­ставляется простым способом снижения продолжительности анализа на 1-2 дня. Ав­томатизация или миниатюризация комплектов для такого анализа снизила время, затрачиваемое оператором для выполнения теста, и значительно упростила выполняе­мые вручную процедуры.

Основная проблема иммунологических систем анализа — это их низкая чувствит­ельность. Минимальное количество микроорганизмов, необходимое системе фермент­ного иммунологического анализа для получения положительного результата составляет примерно 105/мл. Если микробиологу необходимо определить наличие или отсут­ствие какого-либо микроорганизма в 25 г пищевого продукта, всегда требуется стадия обогащения, применение которого увеличивает общую продолжительность анализа на 1-2 сут.

Владимир Заниздра

Основатель сайта Baker-Group.net. Более 25-ти лет опыта в кондитерском производстве. Более 20-ти лет опыта управления. Опыт в организации и проектирования производства с нуля. Сайт: baker-group.net/contacts.html Эл. почта Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Оставить комментарий

Календарь

« Декабрь 2016 »
Пн Вт Ср Чт Пт Сб Вс
      1 2 3 4
5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30 31  

Рекомендуемые материалы