Небиологический синтез АТФ во внеклеточной среде известен [104], но общепризнано, что такие источники АТФ очень редки [62].
АТФ — это высокоэнергетическое вещество, обнаруживаемое во всех живых клетках [104], и необходимый компонент на начальных биохимических этапах использования субстрата, а также в синтезе клеточного материала.
В работе [84] впервые было показано, что испускание света в реакции биолюминесценции РкойптругаИэ [светляка (летающего)] стимулируется АТФ. Методика определения концентраций АТФ с использованием необработанных экстрактов светляков описана в работе [84], и с тех пор она использована во многих областях в качестве чувствительного и точного метод измерения АТФ. Катализатором реакции, сопровождаемой излучением света, служит фермент люцифераза, обнаруживаемый в светящихся жуках-светляках. Люцифераза принимает участие в следующей реакции:
Реакция, сопровождающаяся испусканием света, эффективна; окисление каждой молекулы люцеферина сопровождается испусканием одного фотона и, таким образом, используется каждая молекула АТФ [112].
В работе [78] впервые было описано использование количественного определения АТФ на основе биолюминесценции светляков для обнаружения присутствия жизнеспособных микроорганизмов. После появления этого первого отчета с помощью метода биолюминесценции выполнен большой объем работ по определению жизнеспособных микроорганизмов в пробах окружающей среды [118]. Поскольку все жизнеспособные микроорганизмы содержат АТФ, можно считать, что метод биолюминесценции достаточно просто использовать для быстрого определения численности микроорганизмов. Исследования, однако, показали, что количество АТФ в различных микробных клетках разное в зависимости от вида, обеспечения питанием, отрицательных воздействий и стадии роста [118,119]. Поэтому при использовании биолюминесценции важно учитывать следующее:
- тип определяемого микроорганизма (обычно вегетативные бактерии содержат по 1 фемтограмму (фг) АТФ на клетку [72], дрожжи содержат его в десять раз больше [ 118], а споры вообще не содержат АТФ [ 113]);
- подвергались ли клетки отрицательному воздействию (например, истощению питательных веществ, охлаждению или изменению pH); в таких случаях перед тестированием может потребоваться короткое восстановление;
- находятся ли клетки в среде, в которой относительно мало АТФ (такой, как среда для выращивания), или в сложной матрице (такой, как пищевой продукт) с очень высоким фоновым содержанием АТФ.
При тестировании проб пищевых продуктов одна из самых больших проблем — это последний из вышеуказанных пунктов. Все продукты содержат АТФ, и его содержание обычно значительно выше его содержания в микроорганизмах, обнаруживаемых в этих продуктах. Данные [113] показывают, что соотношение АТФ продуктов к АТФ бактерий варьирует от 40 ООО : 1 (в мороженом) до 15 : 1 (в молоке). Поэтому, чтобы использовать определение АТФ в качестве экспресс-теста для определения микроорганизмов в пищевых продуктах, были разработаны методы отделений микробной АТФ. Были изучены методы двух типов: физическое отделение микроорганизмов от других источников АТФ и использование специфических экстрагирующих веществ для удаления и разрушения немикробной АТФ. Методы фильтрации были успешно применены для выделения микроорганизмов из напитков [77,79] и проб пивоваренного производства [65]. Эти методы, однако, сложно применить к растворам, содержащим макрочастицы, так как фильтры быстро засоряются. Возможный способ решить эту проблему основан на применении схемы двукратной фильтрации [80], в которой первый фильтр удаляет остатки пищевого продукта, но пропускает микроорганизмы, а второй фильтр задерживает микроорганизмы перед лизисом и биолюминесцентным анализом. Другие исследователи [8,120] для избирательного отделения остатков продукта или микроорганизмов перед биолюминесцентными тестами применяли ионообменные смолы.
В результате тщательных исследований избирательной химической экстракции была показана возможность успешного применения ее для отделения микробного и немикробного АТФ для молока [25] и мяса [18]. Обычно в этом методе используется лизис соматических (пищевых) клеток с последующим разрушением выделенного АТФ ферментом (апиразой). Затем можно применить более сильный экстрагент для разложения микробных клеток, и далее — тестирование с помощью люциферазы. Такой метод позволяет определять только микробный АТФ.
Выпускается ряд приборов, предназначенных специально для определения микробного АТФ. Фирмы Lumac (Нидерланды), Foss Electric (Дания), Bio Orbit (Финляндия) и Biotrace (Великобритания) производят системы, использующие методы разделения, специально разработанные для определения микроорганизмов в пищевых продуктах. Обычно эти системы работают хорошо и имеют сходные характеристики, включая минимальный порог определения 104 бактерий (103 клеток дрожжей) и время анализа менее 1ч.
Кроме определения в пищевых пробах общего количества жизнеспособных микроорганизмов, имеется ряд сообщений относительно возможных применений АТФ-биолюминесценции в пищевой промышленности. Применение АТФ-анализа к экспрессному определению в санитарии рассмотрено в работе [59] как метод быстрой оценки микробиологического заражения и как метод измерения общей чистоты поверхностей. Именно во втором случае АТФ-измерение может дать уникальный результат. Как отмечалось выше, почти все пищевые продукты содержат АТФ в больших количествах, поэтому с помощью биолюминесцентного метода, позволяющего очень быстро выполнять проверку санитарно-гигиенического состояния, остатки пищевых продуктов на технологической линии можно обнаружить в течение нескольких минут. АТФ- биолюминесценция для контроля гигиенического состояния поверхностей в настоящее время широко применяется в промышленности. Доступность относительно недорогих, портативных и простых в использовании люминометров позволяет многим производителям пищевых продуктов внедрять методы экспресс-тестирования гигиенического состяния, идеальные для контроля в рамках системы НАССР, где гигиеническое состояние поверхности — это критическая контрольная точка. Данные [51] свидетельствуют, что на всех обследованных предприятиях, регулярно применяющих методы гигиенического АТФ-контроля, после внедрения этих методов отмечено улучшение санитарно-гигиенического состояния. Такие системы контроля на основе определения АТФ могут применяться на большинстве пищевых технологических установок, в организациях общественного питания и в розничной торговле, а также для оценки санитарно-гигиенического состояния транспортных средств (например, автоцистерн).
Одной из задач, с которой пока АТФ-биолюминесценция справиться не может, — это определение конкретных микроорганизмов. Можно использовать избирательную среду выращивания для определенных микроорганизмов при их избирательном выращивании перед АТФ-анализом. Такой подход может, однако, значительно увеличить продолжтельность анализа, в связи с чем можно ожидать ошибочно высоких результатов. Возможность успешного использования избирательных лизогенных факторов, высвобождающих АТФ только из определяемых клеток, показана в исследовании, описанном в работе [119]. Набор таких специфических веществ довольно мал, и поэтому метод может иметь ограниченное применение. Возможно, наиболее перспективным методом, разработанным для определения отдельных микроорганизмов, является применение бактериофагов, полученных с помощью генной инженерии [111,126,127].
Бактериофаги — это вирусы, заражающие бактерии. Изучение бактериофагов показало, что некоторые из них весьма избирательны и заражают только определенные виды бактерий. Тем самым можно вводить в бактериофаги генетическую информацию, вызывающую производство бактериальной люциферазы. Таким образом, когда бактериофаг заражает определенную бактерию-«хозяина», она производит люциферазу и начинает люминесцировать. Этот метод требует тщательного выбора бактериофага для исключения ошибочных положительных или отрицательных результатов, однако исследования показывают, что в будущем методы, основанные на люминесценции, могут быть использованы для экспресс-определения конкретных микроорганизмов [124].
В заключение можно отметить, что использование АТФ-биолюминесценции в пищевой промышленности уже развито до такого состояния, при котором она может быть надежно использоваться для экспресс-определения жизнеспособных микроорганизмов (если применяется эффективный метод отделения для микробной АТФ). Потенциальная возможность использования этого метода в экспресс-анализах гигиенического состояния в настоящее время общепризнана. Исследования также показали, что люминесценция делает возможным экспресс-определение конкретных микроорганизмов, но такая система перед ее широким применением в пищевой промышленности должна быть хорошо отработана.
Методы микроскопии
Микроскопия — это признанный и несложный метод определения количества микроорганизмов. Одно из первых описаний ее использования относится к быстрому подсчету бактерий в пленках молока, окрашенных метиленовым синим [26]. Одно из основных достоинств микроскопических методов — скорость, с которой могут быть выполнены отдельные анализы; однако следует учесть большой объем ручной работы и возможность усталости оператора, вызванной непрерывным подсчетом.
Использование флюоресцентных красителей вместо традиционных окрашенных соединений позволяет упростить подсчет, в связи с чем такие красители стали объектом многих исследований. Микробиологи-экологи сначала использовали такие соединения, чтобы сделать видимыми микроорганизмы в природной воде и подсчитать их [50, 67]. Использование поликарбонатных мембранных фильтров из нуклепора (nuclepore) для отделения микроорганизмов перед флуоресцентным окрашиванием впервые описано в работе [58]. Подсчет детально рассмотрен в работе [ 100], и разработанный авторами метод известен как метод прямой эпифлуоресцентной фильтрации (direct epifluorescent filter technique, DEFT).
Метод DEFT — это трудоемкий ручной метод, что дало толчок исследованиям в области автоматизированных флюоресцентных микроскопических методов (с автоматической пробоподготовкой и высокой производительностью). Первым полностью автоматизированным прибором, основанным на флюоресцентной микроскопии, был Bactoscan (фирмы Foss Electric, Дания), который был разработан для подсчета бактерий в молоке и моче. Пробы молока, помещенные в прибор, подвергаются химической обработке для разложения соматических клеток и растворения казеиновых мицелл. Затем бактерии отделяются с помощью непрерывного центрифугирования до градиента декстрана/сахарозы. Затем микроорганизмы выращивали с протеазой для удаления остаточного белка, после чего их окрашивали акридином оранжевым и наносили в виде тонкой пленки на вращающийся под микроскопом диск. Люминесцентное излучение от изображения в микроскопе превращается в электрические импульсы и записывается. Bactoscan широко применяется для проверок сырого молока в континентальной Европе и дает хорошую корреляцию результатов с данными, полученными традиционными методами [71]. Метод, однако, имеет низкую чувствительность (примерно 5 х 104 клеток на мл), что препятствует его использованию для проб с малым количеством бактерий.
Для пищевой промышленности был разработан инструментальный флюоресцентный метод подсчета, в котором пробы наносились на тонкую пластиковую ленту. Прибор Autotrak наносил пробы на ленту, которая пропускалась через окрашивающий и промывной растворы, а затем проходила перед флюоресцентным микроскопом. Световые импульсы от окрашенных микроорганизмов затем подсчитывались фотоумножителем. Анализ проб пищевых продуктов с помощью этого прибора показал [13], что пищевые остатки проб мешали окрашиванию и подсчету, а результаты оказались значительно выше полученных путем подсчета общего количества жизнеспособных микроорганизмов.
Вероятно, самый новый метод флюоресцентной микроскопии, примененный в пищевой промышленности для экспресс-подсчета, — это проточная цитометрия. Окрашенная проба пропускается под флюоресцентным микроскопом в виде жидкости в проточной ячейке. Световые импульсы, вызванные попаданием света на окрашенные частицы, поступают на фотоумножитель и подсчитываются. Этот автоматизированный экспресс-метод потенциально является очень гибким. Из рассмотренных выше методов микроскопии, вероятно, наиболее широко применяется DEFT, а проточная цитометрия весьма перспективна. Ниже мы их рассмотрим подробнее.
Метод DEFT
Метод DEFT был разработан для экспресс-подсчета количества бактерий в пробах сырого молока [99,100]. Метод основан на предварительной обработке пробы молока в присутствии протеолитического фермента и поверхностно-активного вещества при 50 °С с последующей мембранной фильтрацией, отделяющей микроорганизмы. Предварительная обработка служит для разложения соматических клеток и растворимых жиров, которые могли бы заблокировать мембранный фильтр. После фильтрования мембрану окрашивают флюоресцентным красителем, связывающим нуклеиновую кислоту, акридином оранжевым, затем промывают и помещают на предметное стекло. После этого мембрану рассматривают через эпифлуоресцентный микроскоп, который освещает мембрану ультрафиолетовым светом (при этом краситель испускает видимый свет, который можно наблюдать через микроскоп). Поскольку краситель связывается с нуклеиновыми кислотами, он концентрируется в клетках микроорганизмов, связываясь с молекулами ДНК и РНК; таким образом, любой микроорганизм на мембране можно легко увидеть и подсчитать. Полную предварительную обработку и подсчет можно выполнить всего за 30 мин.
Хотя метод DЕFТ позволял осуществить подсчет очень быстро, он был очень трудоемким, поскольку вся предварительная обработка и подсчет выполнялись вручную, и поэтому производительность этого метода была очень мала. Разработка полуавтоматических методов подсчета на основе анализа изображений [99] позволила преодолеть некоторые проблемы ручного подсчета и тем самым сделала метод более удобным для пользователя.
За работой по использованию DEFT для подсчета клеток в сыром молоке последовал анализ других видов продуктов. Вскоре было установлено, что хорошая корреляция между результатами DEFT и традиционно полученным общим числом жизнеспособных микроорганизмов в пробах сырого молока, отсутствует при анализе молока, прошедшего тепловую обработку [98]. Первоначально полагали, что это связано с изменениями грамположительных кокков при термоиндикаторном окрашивании [98], однако позже было показано [3], что подобные изменения происходят как в грамположительных, так и в грамотрицательных микроорганизмах. Схожие явления при окрашивании также наблюдались в случае тепловой обработки дрожжей [106] и в облученных пищевых продуктах [14], в связи с чем применение DEFT в качестве метода быстрого определения общего количества жизнеспособных микроорганизмов ограничено в основном сырыми продуктами.
Перечень типов продуктов, для которых может использоваться метод DEFT, в настоящее время расширился. В литературе описано применение этого метода для замороженного мяса и овощей [108], сырого мяса [114], алкогольных напитков [33, 115], томатной пасты [101], кондитерских изделий [96], обезвоженных пищевых продуктов [92] и санитарно-гигиенического контроля [60]. Кроме того, некоторые исследователи [107] писали о возможной модификации метода для выявления и подсчета определенных групп микроорганизмов.
В заключение отметим, что DEFT— это очень быстрый метод подсчета общего количества жизнеспособных микроорганизмов в сырых продуктах, успешно применяемый в промышленности. К его недостаткам относятся отсутствие избирательности и неспособность дать точную оценку количества жизнеспособных микроорганизмов в обработанных пищевых продуктах. Первая проблема может быть решена путем применения коротких стадий избирательного роста или антител с флюоресцентным мечением, но подобные решения требуют затрат времени и денег. Проблема обработанных продуктов может быть решена только путем исследований других систем окрашивания, маркирующих жизнеспособные клетки; в работе [15] показана плодотворность такого подхода и перспективность метода при выпуске и внедрении флюоресцентных красителей для жизнеспособных микроорганизмов. Тем не менее в настоящее время большая трудоемкость и низкая производительность метода DEFT ограничивает его применение в пищевой промышленности.
Проточная цитометрия
Проточная цитометрия — это метод, основанный на экспресс-измерении клеток при их прохождении в потоке жидкости мимо точки считывания [28]. Исследуемые клетки вводят в центр потока жидкости (жидкости-носителя). Это заставляет их проходить по одной мимо датчика и делает возможным регистрацию каждой частицы, а не получение усредненных значений для всей популяции. В точке считывания имеется пучок света (ультрафиолетового или лазерного), нацеленный на контролируемый поток, и один или несколько детекторов, измеряющих рассеяние света или флюоресценцию при прохождении частиц под пучком света. Расширение применения проточной цитометрии в исследовательских лабораториях в основном обусловлено разработкой надежных приборов и многочисленных систем окрашивания. Красители, которые могут быть использованы с приборами для проточной цитометрии, позволяют выполнять самые разнообразные измерения. Исследованы флюоресцентные датчики, основанные на активности ферментов, на содержании нуклеиновых кислот, мембранного потенциала и pH; использование же флюоресцентных красителей, соединенных с антителами, придает системе избирательность.
Проточные цитометры использовались для изучения ряда эукариотических и прокариотических организмов. Работа с эукариотами включала исследование патогенной амебы [89] и культуры дрожжей [64], а исследования бактерий включали исследование роста Escherichia coli [122], подсчет клеток бактериальных культур [103] и определение разновидностей Legionella в воде градирен [125].
Методы проточной цитометрии для пищевой промышленности освещаются в [130]. В работе [41] исследовалось использование антител, меченых флюоресцентными веществами, для определения Listeria monocytogenes в молоке, причем были получены обнадеживающие результаты. Использованный в данной работе метод основан на селективном выращивании организмов в течение суток и последующем окрашивании их поливалентными антителами Listeria, меченными флюоресцеиновым изотиоциа- натом. Затем окрашенные клетки пропускали через проточный цитометр и определяли L. monocytogens. Было высказано предположение, что эта система может быть использована и с другими видами продуктов. Подобный подход использовали также в работе [82] для определения Salmonella typhimurium в молочных продуктах.
В [94] исследовалось применение проточного цитометра Argus для подсчета бактерий в чистых культурах и пищевых продуктах. Результаты, полученные с чистыми культурами, показали хорошую корреляцию подсчетов, полученных на проточном цитометре, с подсчетами на пластинках до концентраций 103 клеток на грамм, но для пищевых продуктов были получены противоречивые результаты. Применение этого метода для проб мяса дало хорошее совпадение с подсчетами на пластинках и позволило проводить подсчет до 105 клеток на грамм. Результаты для молока и паштета были хуже, причем чувствительность системы для паштета составляла 106 клеток на 1 мл, а клетки, введенные в молоко, не обнаруживались на уровне более 107 на 1 мл. Низкая чувствительность этого проточного цитометра при измерениях на продуктах была отнесена за счет влияния системы подсчета, вызванного пищевыми остатками; авторами было высказано предположение, что решить эту проблему можно, применив методы разделения клеток микроорганизмов и пищевых остатков.
Наиболее успешно методы проточной цитометрии применяются для пищевых продуктов при использовании системы Chemunex ChemflowRjin обнаружения загрязняющих дрожжей в молочных и фруктовых продуктах [6]. Методика, используемая при работе с этой системой, требует инкубации продукта в течение 16-20 ч с последующим центрифугированием для отделения и концентрирования клеток. Затем добавляется краситель, и проба пропускается через проточный цитометр для анализа. Оценка системы [97] на примере безалкогольных напитков, заквашенных дрожжами, показала, что она надежна и удобна в работе. Данные цитометра хорошо совпадали с данными метода DEFT, однако автор не привел результатов сравнения данных системы с результатами подсчетов на пластинках.
В исследованиях системы Chemflow, описанных в работе [6], использовались различные молочные и фруктовые продукты, заквашенные дрожжами. Результаты свидетельствовали, что дрожжи могли быть обнаружены в молочных продуктах через сутки при наличии лишь 1 клетки на 25 грамм. Во фруктовых соках была также получена аналогичная чувствительность, но для ее достижения требовалось уже 48 ч. Система показала свою надежность и удобство в работе и в настоящее время адаптирована для обнаружения как дрожжей, так и бактериальных клеток; существуют также варианты ее применения для биомассы ферментера и подсчета общей микрофлоры в овощах. Система Chemflow прошла полные испытания в условиях производства при анализе кисломолочных продуктов [43]. Авторы этой работы указывают на очень хорошее соответствие результатов подсчета на цитометре и на пластинке (г = 0,98), причем результаты получаются через 24 ч, что означает экономию трех суток по сравнению с классическими методами.
В заключение отметим, что проточная цитометрия может обеспечить быстрый и чувствительный метод быстрого подсчета микроорганизмов. Успешная работа системы зависит от разработки и применения
а) соответствующих систем окрашивания и
б) процедур отделения микроорганизмов от остатков пищевых продуктов, которые в противном случае мешают работе системы определения. В будущем проточный цитометр, снабженный рядом систем фотодатчиков, мог бы позволить проводить анализ проб одновременно по многим параметрам, значительно упрощая режимы тестирования.
Твердофазная цитометрия
Относительно новый вариант цитометрии разработан компанией Chemunex (r. Мезон- Альфор, Франция) на основе твердофазной цитометрии. В этом варианте пробы проходят через мембранный фильтр, который задерживает заражающие микроорганизмы. Затем, чтобы пометить метаболически активные клетки микроорганизмов, на фильтр наносится флюоресцентный краситель. После окрашивания мембрану переносят в прибор Chemscan RDI, который сканирует всю мембрану с помощью лазера, подсчитывая флюоресцирующие клетки. Выполнение процедуры занимает около 90 мин и позволяет определять отдельные клетки в пробе на фильтре. Система для твердофазной цитометрии Chemscan RDI— это мощный инструмент для быстрого подсчета малых количеств микроорганизмов. Она идеально пригодна для анализа воды или других чистых фильтрующихся жидкостей, а применение специфических методов мечения может быть использовано для избирательного выявления определенных микроорганизмов. Пищевые продукты с крупными частицами могут, однако, мешать анализу, так как микроорганизмы перед фильтрованием и анализом должны быть отделены от пищевого материала.
Иммунологические методы. Антитела и антигены
Иммунологические методы основаны на реакции специфического связывания, которая протекает между антителом и соответствующим антигеном. Антитела — это белковые молекулы, которые производятся лейкоцитами в ответ на контакт с веществом, вызывающим иммунную реакцию. Область, к которой антитело прикрепляется на молекуле, известно как антиген. Антигены, используемые в иммунохимических методах, бывают двух типов: первый возникает, когда определяемое вещество имеет низкий молекулярный вес и само поэтому не стимулирует иммунную реакцию — такие вещества называют гаптенами (неполноценными антигенами), и они, чтобы вызвать иммунную реакцию и образование антител, должны быть связаны с более крупной молекулой- носителем. Второй тип антигена является иммуногенным и может сам вызвать иммунную реакцию.
В иммунологических тестах могут применяться два типа антител: моноклональные и поликлональные антитела. Поликлональные антитела образуются при использовании для стимуляции иммунной реакции больших молекул (таких, как белки или целые бактериальные клетки). Наличие большого количества антигенных участков приводит к образованию множества различных антител в качестве реакции на молекулу или клетку. Моноклональные антитела образуются с помощью культур клеток ткани от одного лейкоцита; это означает, что они нацелены на один антигенный участок. Связывание антигена очень специфично, и поэтому иммунологические методы могут использоваться для обнаружения определенных микроорганизмов или белков (например, токсинов). Во многих случаях при использовании этих методов к антителу прикрепляется метка, чтобы при связывании оно было легко заметно.
Метки
С антителами могут быть использованы метки многих типов, включая радиоактивные метки, флюоресцирующие вещества, светящиеся вещества и ферменты; кроме того, для обнаружения связывания антитела с антигеном могут использоваться реакции агглютинации.
Радиоизотопы широко применяются как метки в основном из-за высокой чувствительности, которой можно достигнуть с их помощью. Тем не менее они обладают некоторыми недостатками, основным из которых является потенциальная опасность реагентов. Это препятствует их применению где-либо, кроме специальных лабораторий, и естественно, возможность их использование в пищевой промышленности вызывает большие сомнения.
Флюоресцентные метки широко применяются для изучения микроорганизмов. Наиболее часто используемый реагент — это флюоресцеин, но используются и другие, например, родамин и умбеллиферон. Самый простой случай использования флюоресцентных антител — это микроскопия. Последние достижения в этой области — применение проточной цитометрии для многопараметрического проточного анализа окрашенных препаратов и разработка иммунофлюоресцентного метода анализа с помощью иммобилизованного фермента (ЕLIFА), причем некоторые методы были автоматизированы.
Светящиеся (люминесцентные) метки исследовались как альтернатива потенциально опасным радиоактивным [75]. Метки могут быть как хемилюминесцентными, так и биолюминесцентными, и их достоинством по сравнению с радиоактивными является простота использования и измерений, выполнимых на простом оборудовании при аналогичной чувствительности [109]. В ряде исследовательских работ успешно использовался иммунолюминометрический анализ [81], но свидетельств его внедрения в производство пока нет.
Антитела используют для определения антигенов в реакциях осаждения и агглютинации. Такие анализы выполнить количественно обычно труднее, чем другие виды иммунологического анализа, и поэтому они используются для качественной оценки. Анализы проводятся просто и быстро, требуя минимального аппаратурного оснащения.
Ряд реакций осаждения уже успешно внедрен в пищевую промышленность. Эти методы использовали в основном для подтверждения тождества микроорганизмов, а не для определения заданных микроорганизмов. Время анализа с помощью этих методов относительно невелико, их просто использовать и обычно они не требуют специального оборудования, что делает их идеальными для лабораторий, выполняющих стандартные испытания.
Выпускается несколько комплектов для латексных агглютинационных проб для определения Salmonella в пищевых продуктах. Среди них Oxoid Salmonella Latex Kit (Oxoid), созданный для использования с тестовым комплектом Oxoid Rapid Salmonella Test Kit [61]; комплект Micro Screen Salmonella Latex Slide Agglutination Test (Mercia Diagnostics Ltd.); комплект Wellcolex Colour Salmonella Test ( Wellcome Diagnostics) [53,54] и Spectate Salmonella test (Rhone Poulenc Diagnostics Ltd.) [29]. В последних двух комплектах используются смеси окрашенных латексных частиц, которые позволяют не только определять, но и выявлять серологические группы Salmonella. Комплекты для латексных агглютинационных проб также выпускаются для Campylobacter (Microscreen, Mercia Diagnostics), Staphyloccocus aureus (Staphaurex, Wellcome Diagnostics), Shigella ( Wellcolex Colour Shigella Test, Wellcome Diagnostics) и Escherichia coli 0157:#7 {Oxoid). Агглютина- ционные пробы также разработаны для определения микробных токсинов, например, проба Oxoid Staphylococcal Enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination Test [5,110].
Ферментный иммунологический анализ широко исследовался в качестве метода для экспресс-определений пищевых микроорганизмов. Достоинством такого анализа является его специфичность, достигаемая за счет использования специфических антител в сочетании с цветными или флюоресцентными конечными точками, которые легко обнаружить визуально или с помощью спектрофотометра. Большинство серийно выпускаемых комплектов для иммунологического анализа используют метод «сэндвичей» из антител, чтобы сначала захватить, а затем определить специфические микробные клетки или токсины. Комплекты поставляются с двумя видами антител: иммобилизованными и конъюгированными. Иммобилизованное антитело прикреплено к твердой подложке, например, к микротитровальной пластинке-ячейке. Обогащенная пищевая проба может быть добавлена в ячейку, и антигены из любой присутствующей определяемой клетки связываются с антителами. Ячейку промывают, удаляя пищевые остатки и несвязанные микроорганизмы. Затем в ячейку могут быть добавлены конъюгированные с ферментом антитела. Они связываются с определяемыми клетками, образуя «сэндвич» из антител. Несвязанные антитела можно затем вымыть из ячейки и добавить ферментный субстрат. Любой присутствующий фермент превращает бесцветный субстрат в окрашенный продукт. Выполнение типичного ферментного иммунологического анализа на микропластинке занимает 2-3 ч и показывает присутствие предполагаемых бактериальных клеток. Результаты анализа проб, показывающие положительный результат, должны всегда подтверждаться биохимически или серологически.
Выпускается ряд комплектов для ферментного иммунологического анализа, позволяющих определять в пищевых пробах Listeria, Salmonella, Escherichia coli 0157, Staphylococcal enterotoxins и токсин Bacillus diarrhoeal. Чувствительность этих систем составляет примерно 106 клеток/мл, поэтому перед анализом должна применяться соответствующая процедура обогащения пробы. Таким образом, результаты могут быть получены через 2-3 суток, а не через 3-5, как при традиционных тестах.
В последние годы был разработан ряд автоматизированных вариантов иммунологического анализа, что делает этот ускоренный метод еще менее трудоемким. Автоматизация ферментного иммунологического анализа выполняется по-разному — ряд производителей продают приборы, которые просто автоматизируют стандартные методы ELIS А (твердофазного иммуносорбентного анализа) на микропластинке. Эти приборы содержат емкости с реагентами и используют роботизированную автоматическую пипетку, которая подает различные необходимые реагенты в правильной последовательности. Автоматизацию анализа завершает автоматическая промывка и считывание, снижая его трудоемкость. Существуют по меньшей мере две фирмы-изготовителя, выпускающие оригинальные системы с комплектами для иммунологического анализа на автоматизированном приборе.
В системе Vidas (bioMerieux, г. Бэйзингсток, Великобритания) используется тестовая полоска, содержащая все реагенты, необходимые для ELIS А. Первая лунка полоски инокулируется обогащенной пищевой пробой и помещается в прибор Vidas вместе с кончиком пипетки, покрытым изнутри иммобилизованным антителом. Прибор затем с помощью кончика пипетки перемещает анализируемую пробу в другие ячейки полоски с различными реагентами, необходимыми для выполнения анализа. Все перемещения полностью автоматизированы, как и получение конечных результатов теста. Анализ методом ELISA на приборе Vidas может выполняться для различных микроорганизмов, включая Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E. coli 0157, Campylobacter и стафилококковый энтеротоксин. По результатам сопоставления [20,22] было отмечено, что по результатам этот автоматизированный анализ, по крайней мере, эквивалентен традиционным методам испытаний.
Система EIAFOSS (Foss Electiic, Дания) представляет собой полностью автоматизированную система для твердофазного иммуносорбентного анализа. В этой системе все реагенты автоматически переносятся в пробирки с пробами, в которых происходят все реакции. В приборе EIAFOSS реализована оригинальная процедура, использующая магнитные бусины, покрытые антителами в качестве твердой фазы. В ходе анализа эти бусины иммобилизуются с помощью магнита, установленного под пробиркой с пробой. Комплекты для анализа с помощью прибора EIAFOSS выпускаются для Salmonella, Listeria, E.coli 0157 и Campylobacter, при этом исследования подтердили хорошую их работу [68].
Новейшая внедренная в промышленность версия иммунологического анализа является едва ли не самой простой. Иммунохроматография работает с помощью щупа, состоящего из наполнителя-абсорбента, который содержит цветные частицы, покрытые антителами для определенного микроорганизма. Частицы находятся на нижней части щупа, и когда его опускают в бульон для микробиологического обогащения, они двигаются вверх по наполнителю (жидкость движется под действием капиллярных сил). В определенной точке наполнителя расположен ряд иммобилизованных специфических антител. При наличии определяемого микроорганизма происходит его связывание с цветными частицами. Этот конъюгат клеток и частиц движется вверх по щупу под действием капиллярных сил до тех пор, пока не встречается с иммобилизованными антителами, к которым он «приклеивается». Накопившиеся цветные частицы образуют явно видимую цветную линию, указывающую на положительный результат теста.
На этой процедуре основан ряд коммерческих комплектов, в том числе Oxoid Listeria Rapid Test [69] и Celsis Lumac Pathstik [70], которые продемонстрировали хорошие результаты. Методы иммунохроматографии, как и другие методы иммунологического анализа, требуют обогащения, но для них не нужны особые приборы или оборудование, и после контакта щупа с пробой требуется лишь несколько минут, чтобы увидеть положительный или отрицательный результат.
Краткие выводы
Иммунологические методы уже всесторонне изучены и внедрены. В настоящее время имеется ряд систем, делающих возможным экспресс-определение специфических микроорганизмов, для которых они предназначены. Многочисленные испытания промышленно освоенных приборов для иммунологического анализа показали, что их результаты в основном хорошо соответствуют полученным традиционными микробиологическими методами. В частности, ферментный иммунологический анализ представляется простым способом снижения продолжительности анализа на 1-2 дня. Автоматизация или миниатюризация комплектов для такого анализа снизила время, затрачиваемое оператором для выполнения теста, и значительно упростила выполняемые вручную процедуры.
Основная проблема иммунологических систем анализа — это их низкая чувствительность. Минимальное количество микроорганизмов, необходимое системе ферментного иммунологического анализа для получения положительного результата составляет примерно 105/мл. Если микробиологу необходимо определить наличие или отсутствие какого-либо микроорганизма в 25 г пищевого продукта, всегда требуется стадия обогащения, применение которого увеличивает общую продолжительность анализа на 1-2 сут.
Останні коментарі