Размножение и отмирание микроорганизмов при низких температурах.

Затем начинается процесс размножения. В течение опре­деленного периода размноже­ние идет с постоянной ско­ростью. Это — логарифмиче­ская фаза роста. Зависимость логарифма количества бакте­рий от времени графически здесь может быть изображена прямой.
В качестве показателя ско­рости размножения (деления) бактерий в логарифмической фазе обычно принимается про­должительность генерации, т. е. время, требуемое для деления бактерии на 2.Отсюда

		Температура, °С
Бактерии	-2	0	2	4	10	20
Pseudomonas sp. № 99 (в часах) …	50	45	42	1	1	1
Ps. fluorescens (в днях)	14	8	3,5	1,5	-1

Таблица 8. Лагфаза (в часах) смешанной микро­флоры при разных температурах

Продукт	Температура			С
	0	2,5	6	10
Фарш	24	18	2	0
Котлеты	28	15	2	0

Если же бактерии уже находились при низкой температуре и были в активном состоянии, то рост их при попадании на новый субстрат в этих же условиях начинается после очень непродол­жительной задержки (см. рис. 7). Таким образом, при холодильном хранении не следует допускать соприкос­новения свежего продукта с тарой и инвентарем, кото­рые в загрязненном виде на­ходились на холоде и, сле­довательно, были обсемене­ны активно размножающи­мися микроорганизмами.
 Замедление активности роста (удлинение продол­жительности генерации) при понижении температуры чистых и смешанных культур психрофильных бактерий показано на рис. 8, 9 и в табл. 9 и 10.
  Значение продолжительности генерации на различных продук­тах при разных температурах по данным других исследователей приводится на стр. 38, 56, 57.
 Рост каждой группы микроорганизмов происходит в определен­ных пределах температур. Например, пределы роста Bact. coli от 10 до 49°, т. е. в температурном диапазоне ~40°. Бактерии Pseudomo­nas и Achromobacter растут от —5° до 35°; температурный диапа­зон перемещен в сторону более низких температур, но он примерно такой же величины. Из этого следует, что глубокие изменения в ха­рактере процесса роста и размножения микроорганизмов происхо­дят в небольшом температурном диапазоне.
Размножение микроорганизмов—это результат ряда последо­вательных и параллельных химических реакций, причем продукты
Рис. 8. Продолжительность генерации бактерий на мясе: I — Achromobacter sp. N 7, // — Achromobacter sp. N 483, III — Achromobacter sp. N 5
Генерация в часах (ip)

 Рис. 9. Продолжительность генерации бактерий в молоке и сливках:
| — Pseudomonas sp. в молоке, || — Pseudomonas sp и сливках,||| — Лег. aerogenes в молоке, IV — Str. faecalis в молоке dlnk/dt=A/(RT₂)
Таблица 9
Продолжительность генерации (в часах) бактерий в вареных мясных средах при разных температурах

Среда	Бактерии	Температура, °С
		-2,1	-1,8	-0,2	0	1.7	2	2,2	4,1	4,4	7,8	8,6	10	20
Мясной фарш Мясной бульон	Achromobacter sp. Pseudomonas fluorescens Pseudomonas sp. № 99	25,5 25,4	18,3	18.7 18.8	13,4	9,4	13,4	12,8	9,9 10,7	6,6	3,7	4,8	3,9	2,4

Продукт	Температура, °С
	-2	0	2,5	4	б	7	10	18
Дефростированная килька  Мясной фарш …. Мясные котлеты . . .	19,5	15,7 23.5 27.6	15,7 12,9	7,6	7.7 6.7	5,6	5,5 3,9	1.7

Таблица 10 Продолжительность генерации (в часах) смешанной культуры бактерий на кильке и на сырых мясных полуфабрикатах при разных температурах
одной реакции могут являться исходными соединениями другой. Нарушение этой последовательности может служить причиной на­рушения всего процесса роста и привести в конечном итоге к отми­ранию.
Одной из причин нарушения такой последовательности может быть неодинаковое изменение с температурой скорости происходя­щих реакций.
Зависимость скорости химической реакции от температуры можно выразить уравнением Аррениуса:где:
к —скорость реакции;
t —время;
Т — абсолютная температура;
R — газовая постоянная;
А — постоянная энергия активации, т. е. энергия, которой дол­жны обладать молекулы для вступления в реакцию. Предположим, что скорость роста зависит от скорости какой-нибудь одной реакции в последовательности реакции роста. Зави­симость скорости роста от температуры тогда должна будет вы­ражаться уравнением, приведенным выше. Изображение этого уравнения в полулогарифмическом масштабе, т. е. изображение
зависимости lnk от —, будет прямой линией.
 Графическое изображение зависимости lg g от — для бактерий Pseudomonas sp. № 99 показано на рис. 10. В узком интервале тем­ператур от 271 до 283° К имеет место прямолинейная зависимость
lg g от —, после чего прямая резко преломляется. Начиная с этого
момента вступает в силу другая реакция с другим температурным коэффициентом; она и определяет продолжительность генерации. Из наклонов прямых (см. рис. 10) видно, что 
имеем
При R=1,987 кал/°С моль
А = 2,3 X 5,2 X X 1,987 = 2,38 X 10⁴ кал/моль
для интервала от —2 до 10°.
От 10 до 20° наклон становится значительно более пологим:
= 1,77 X и Л = 4,06Х
В микробиологической практике изменение скорости размноже­ния (и других процессов) обычно выражают через температурный            Рис. 10. Зависимость Igg от — для Pseudomonas sp. N 99коэффициент Q₁₀, т. е. отношением констант скоростей при разности температуры в 10°.
Пусть k и k соответствуют скорости генерации при Т и T. Тогда 
     В температурном интервале в 10° (по сравнению с абсолютной температурой ~ 300°)
 т.е. LnQ₁₀ в небольшом температурном интервале почти постоянный
Так как

Рис. 11. Зависимость lg g от Т для Pseudomonas (/) и Achromobacter (//)
то при условии Т₁— исходная (постоянная) температура и T ₂ —lgg₂= C-C₁T,
т. е. в небольшом температурном интервале (от 273 до 283°) lgg — практически линейная функция от абсолютной температуры, как это было найдено эмпирически с различными бактериями (рис. 11).
В случае повышения температуры здесь также можно наблю­дать резкий перегиб.
В табл. 11 приведены данные по температурному коэффициенту размножения бактерий. Температурный коэффициент имеет различные

Бактерии	Среда	Температура, ⁰С
		от 30 до 37	от 20 до 30	от 15 до 20	от 10 до 15	от 5 до 10	от 0 до 5
Str. faecalis [26]	Молоко	1,2	2,4	4,4		8,6	7
Pseudomonas sp. [27]*			1,83	2,1	5,14	4,64	5,17
Pseudomonas sp. [27]	Сливки		2,53	1,94	6,05	5,07	7,74
Aer. aerogenes [27]	Молоко		1,62	3,01	3,29	8,99	8,36
			от 20 до 25	от 15 до 20	от 10 до 15	от 4 до 10	от 2 до 4	от —1 до 2
Achromobacter : sp. № 7 [28]	Поверхность мяса		1,37	1,65	2,05	3,44	4,4	3,93
» № 483 [28]	То же » »		1,55	1,75	2,11	4,09	3,76	3,71
» № 5 [28]			1,38	1,69	2,76	4,38	4,78
					от 4,1 до 8,6	от 2,2 до 4,1	от —0,2 до 2,2	от —2,1 до—0,2
Ps. fluorescens [24]	Мясной вареный фарш				5,56	3,92	4,83	5,14
					от4,4 до 7,8	от 1,7 до 4,4	от 0 до 1,7	от —1,8 до 0
Achromobacter sp. [24]	То же » »				5,45	3,71	7,96	6,5
					от 6 до 10	от 2,5 до 6	от 0 до 2,5
Смешанная микро­флора [24]	Мясной сырой фарш				2,32	7,67	5,02
To же	Мясные сырые котлеты				3,9	6,5	13,57
				от 7 до 18			от 0 до 7	от —2 до 0
To же	Сырая килька			3,06			4,23	2,96

* Рассчитано нами
значения в разных интервалах температур, примем при болёё низких температурах этот коэффициент принимает большие значе­ния (от ~3,5 до ~8).
Высокое значение температурного коэффициента при низких температурах очень важно в практическом отношении. Оно пока­зывает, что даже очень небольшое отклонение температуры в этом диапазоне может или удлинить срок хранения продукта или, наобо­рот, вызвать ускорение его порчи
Аналогичную температурную зависимость показывают плесени.
. Рис. 12. Рост плесени Thamnidium elegans при разных температурах (по Бочаровой)
На рис. 12 видно изменение диаметра колоний Thamnidiumelegans при температурах 20, 10, 5, 2, 0, —5 и —8°. При темпера­туре —8° рост начался только после 40 дней и был очень медленным, в то время как при 20, 10 и 5° рост был почти прямолиней­ным и с очень малой задержкой [29].
Отмирание микроорганизмов. При понижении температуры до­стигается такая точка, при которой размножение микроорганизмов совершенно прекращается. Микроорганизмы стареют и наступает отмирание. Эта точка называется минимальной температурой роста.
Для мезофильных микроорганизмов, температурный минимум которых лежит выше 0°, процесс отмирания имеет место уже при плюсовых температурах, т. е. до замерзания среды. Для психрофилов отмирание наступает при температурах ниже 0°.
Отмирание микроорганизмов при низких температурах проте­кает медленнее, чем в условиях нагревания.
Скорость отмирания микроорганизмов при других равных условиях зависит от видовой их принадлежности и возраста культуры. Быстрее разрушаются неспоровые бактерии. Из них менее стойкими являются бактерии кишечной группы и протей. Значительно более стойкими к холоду из неспоровых бактерий оказываются стафило­кокки.
Споры бактерий и плесеней выживают в течение очень длитель­ных сроков при низких температурах.
Степень стойкости различных бактерий при температуре ниже температурного минимума роста в различных незамороженных про­дуктах показана в табл. 12.
Таблица 12. Холодоустойчивость бактерий в различных средах при температуре —2°(в % от исходного)

Среда	pH	Выдержка, дни	Кишечная палочка	протей	Стафилококк токсигенный
Рыбный бульон с 3%					36,2
NaCl	6,3	25	2,7	6,2
Салака пряного посола	6,3	30	6	<0,2	-55
Салака дефростирован- ная с добавлением:
3% NaCl	6,6	45	<1	0,1	13
6% NaCl	6,6	45	1	0,1	28
9% NaCl	6,6	45	<1	1	48
Молоко	6,3	30	9,6	24,5	27,7
Молочная сыворотка . .	5,9	30	2	16	18,8
Сметана	5,9	30	7	7,7	88
Творог	4,6	90	0,1	0,1	51
Колбаса вареная . . .	6,3	42	0,1		51

Когда эти бактерии выдерживались в чистой культуре в течение 30 суток при 4, 0 и —2°, то они выживали в большем количестве
Таблица 13.   Холодоустойчивость бактерий через 30 дней выдержки (в % от исходного)

Бактерии	Температура, °С
	4	0	-2
Кишечная палочка . . .	1,5	2,9	14,2
Протей	105	2,2	22,1
Стафилококки	4,8	84,0	79,0

при —2°, чем при температурах, более близких к температурному минимуму размножения (табл. 13).
В условиях Замораживания, когда микроорганизму подвергаются сильному воздействию среды, отмирание происходит бы­стрее, чем в незамороженных средах. В замороженных средах ста­филококки выдерживают более длительное хранение, чем психрофильные бактерии. Различие в скорости отмирания стафилококков и психрофильных бактерий в замороженной среде можно видеть по данным табл. 14 [30].

Таблица 14. Холодоустойчивость бактерий на свежем свином фарше при температуре от —17,8 до —22° ( в % от исходного)

Среда	Бактерии	Исходное содер­жание в 1 г, тыс.	После хранения в течение
			1 недели	1 месяца	5 месяцев	10 месяцев	18 месяцев
Свинина 50%-ной жирно­сти
	Стафилококки	325		<46		15	12,3
То же, 30%-ной жирности­
	»	425		79	17
То же	Психрофилы	1400	43		10	3	0,3

Относительно высокой устойчивостью к замораживанию обла­дают фекальные стрептококки. Так, стерильная куриная подливка инокулировалась примерно одинаковым количеством бактерий Esch, coli, Aer. aerogenes, Str. faecalis u Str. faecal, var. liquefaciens и хранилась при —21° в течение 481 дня. От исходного содержания бактерий кишечной палочки (5600 тыс. в 1 мл) осталось только 66 клеток; от исходного содержания энтерококков (15 млн. в 1 мл) осталось 5 млн., т. е. примерно на уровне исходного [31].
Различие в холодоустойчивости кишечной палочки, протея и стафилококков сохраняется и в условиях замороженной среды. Когда эти бактерии, внесенные в рыбный бульон, замораживались и хранились при —18°, то через 26 дней количество выживших бактерий кишечной палочки и протея составляло только 10 и 12,5% от исходного содержания, а количество стафилококков — 87%, т. е. уменьшилось лишь на 13%. То же наблюдалось при добавле­нии к бульону 6% NaCl. Количество первых двух бактерий упало до 1,2—0,9% от исходного, а стафилококков — всего до 13,5%.
Графическое изображение отмирания микроорганизмов во вре­мени в замороженных субстратах представлено на рис. 13. Коли­чество жизнеспособных клеток снижается в значительной мере на первом этапе замораживания — в процессе замерзания среды. Вы­жившие микроорганизмы при дальнейшем хранении в заморожен­ной среде отмирают медленнее, чем в процессе замерзания. При температурах более низких (—30°) это замедление больше, чем при более высоких температурах (—11° и выше) [32].
Это явление наблюдалось при хранении дрожжей Saccharomy­ces cerevisiae, замороженных при —24°, в течение 77 дней при —24, —15 и —5° [33]. Через 25 дней хранения соответственно оставалось 525 млн., 241 млн. и 34 млн. от исходного (1600 млн.); через 77 дней хранения при —24 и —15° оставалось все еще 27 млн. и 5,9 млн.; в образцах, хранившихся при —4° — только 4290, т. е. примерно в 6000 и 1400 раз меньше, чем при —24 и —15°.
Рис. 13. Отмирание дрожжей в 5,4%-ном рас­творе глюкозы
Скорость отмирания плесеней подчиняется таким же закономер­ностям, как и дрожжи. После выдерживания засеянных плесенями питательных сред при температурах —18,—12 и —8° их помещали в условиях комнатной температуры [5]. Наблюдения показали что культуры, которые подвергались воздействию температуры —18°, оказались менее поврежденными и росли активнее, чем заморожен­ные при температурах —12 и —10° (рис. 14).
Изменение содержания бактерий на палтусе [34] в процессе хра­нения при —10, —15 и —20° также показывает, что при темпера­туре —10° выживает меньше бактерий, чем при —15 и особенно при —20° (табл. 15).
Микроорганизмы в сливочном масле отмирали в большем коли­честве, когда оно хранилось длительное время при —9°, чем при — 18° (рис. 15) [29].
Рис. 14. Рост плесени С1ас1о8рогшт ЬегЬагит после за­мораживания при температурах —18, —12 и —8° (по Бочаровой)
Та же закономерность в отношении отмирания микроорганиз­мов наблюдалась при исследовании молока, рыбы и яиц [34].
Отмирание микроорганизмов при разных температурах прояв­ляется еще более резко в кислых продуктах (табл. 16).

Таблица 15.  Отмирание бактерий при разных температурах (% выживших)

Температура хранения,		Срок хранения,		ДНИ
	115	178	192	206	220
—10	6,1	3,6	2,1	2,1	2,5
—15	16,8	10,4	3,9	10,0	8,2
—20	50,7	61,0	57,4	55,0	53,2

При анализе оттаянной смородины после 4-месячного хранения ее при температуре —9° было найдено всего 4%, а при температуре —18° —80% от исходного содержания микроорганизмов.
В то же время в средах с добавлением 0,9% ЫаС1 (эвтектиче­ская точка —21,2°) дрожжи отмирали быстрее при температуре —30°, чем при более высоких температурах (рис. 16).
Рис. 15. Отмирание бактерий в сливочном масле при температурах —9 и —18° (по Бочаровой)
Большая скорость отмирания микроорганизмов в незамерзших средах при температурах, более близких к минимальной темпера-
Таблица 16. Отмирание микроорганизмов в замороженных ягодах и соках в зависимости от температуры (в % к исходным)

Среда	Продолжи­ тельность хранения	Температура хранения	% выживших	Температура хранения	% выживших
Клубника в сиропе [35]	4 мес.	— 10	11	—20	40
Голубика в 50°/о-ном сиропе [36]­
	9 »	—6,7	0,1	— 17,8	40
Ежевика в 50%-ном сиропе [37]­
	24 нед.	— 10	1	—20	25
Апельсиновый сок (42)
по Бригсу) [38]:
лейконосток			[ <1		14
лактобациллы	40 дней	—9,4	9,5	—17,8	27
дрожжи )			1 34		61

туре размножения, чем при более низких Температурах, возможно объясняется большей скоростью биохимических процессов в пер­вом случае.
Рис. 16. Отмирание дрожжей в 0,9%-ном растворе NaCl
В замерзших средах большее отмирание микроорганизмов при более высоких температурах (выше —18°) объясняется рядом при­чин. Одна из них — наличие при более высоких температурах кон­центрированных раство­ров как в среде, так и в самой клетке, которые действуют на протоплаз­му. При этом немалую роль играет химический состав среды, так как не каждая высококонцен­трированная среда дей­ствует губительно на ми­кроорганизмы. Этим, ве­роятно, объясняется вы­сокая степень отмирания микроорганизмов в кис­лых средах.
При температурах ни­же эвтектической точки растворы переходят в твердое состояние и не действуют на клетки. Ввиду большой выживаемости микроорганизмов при температуре—18° к продуктам, закладываемым на хранение следует предъявлять та­кие же строгие санитарно-гигиенические требования, как при хра­нении в условиях более высоких температур
Следует отметить, что большая выживаемость микроорганизмов при —18°, чем при —9, —12°, отнюдь не противоречит современной тенденции хранения продуктов при более низких температурах. Дело в том, что при более низких температурах качество продукта все же сохраняется дольше, чем при более высоких, так как при этом снижается отрицательное действие других, не микробиаль­ных, факторов.