Традиционные и ускоренные методы микробиологического анализа

Р. П. Бете, Campden and Chorleywood Food Research Association

Введение

Выявление и определение численности микроорганизмов в пищевом продукте или на поверхностях, вступающих с ним в контакт, является неотъемлемой составной частью любого контроля и системы оценки качества. Микробиологические тесты пищевых продуктов можно разделить на два типа: а) количественные, в которых группы микро­организмов в пробе подсчитываются, а результат выражают в виде количества присут­ствующих организмов на единицу массы пробы, и б) качественные («присутствие/ отсутствие»), которые сводятся к обнаружению наличия или отсутствия определен­ного микроорганизма в известной массе пробы.

Основа методов, используемых для обнаружения микроорганизмов в пищевых продуктах, хорошо известна и опирается на введение пищевого продукта в питатель­ную среду, в которой микроорганизмы могут воспроизводиться, что приводит к их видимому росту. Такие методы просты, гибки, удобны и обычно дешевы, но у них есть два недостатка: во-первых, тесты основаны на росте микроорганизмов в среде, что мо­жет занять много времени и ведет к большой длительности теста; во-вторых, методы ориентированы на их выполнение вручную и поэтому трудоемки.

В последние годы выполнен большой объем исследований в области ускоренных автоматизированных микробиологических методов (экспресс-анализа). Цель этих работ заключалась в уменьшении продолжительности тестов (путем применения ме­тодов, отличных от выращивания микроорганизмов для обнаружения и/или подсчета микроорганизмов) и в снижении трудоемкости (путем максимально возможной авто­матизации). Разработанные автоматизированные экспресс-методы получили некото­рое признание в пищевой промышленности и могли бы сформировать важный инстру­мент контроля качества охлажденных продуктов. Результаты экспресс-анализа могут увеличить срок хранения охлажденных продуктов на один-два дня по сравнению с традиционной микробиологической методикой. Кроме того, наличие ускоренных ме­тодов микробиологического экспресс-анализа указывает на наличие возможности уп­равления в реальном масштабе времени и их применения в системе оценки качества по методике НАС СР.

 Отбор проб

Хотя в данной главе рассматриваются методы, применяемые для испытаний пищевых продуктов, для микробиолога особенно важен вопрос отбора проб. Независимо от того, насколько хорош конкретный метод, если проба взята неправильно и не является реп­резентативной для партии продукта, из которого она взята, результаты теста не имеют смысла. Полезно разработать план выборочного контроля, в котором результаты опре­деляются на основе ряда анализов, а не по одному результату. В настоящее время мик­робиологи обычно используют планы выборочного контроля с двумя или тремя набо­рами проб, в которых указывается количество индивидуальных тестируемых проб из одной партии (наряду с действующими микробиологическими пределами). Такие планы выборочного контроля детально описаны в работе [2].

После того, как разработан план выборочного контроля, представительная порция продукта должна быть взята для анализа. Для этого микробиолог должен достаточно детально разбираться в продукте и его микробиологии. Многие охлажденные продук­ты не являются однородными смесями, а состоят из слоев или частей (хорошим при­мером может служить готовый сэндвич). Следует решить, необходим ли микробиоло­гический результат для целого сэндвича (то есть хлеба и начинки), только для хлеба или только для начинки. И действительно, в некоторых случаях может оказаться необ­ходимым проверять одну часть смешанной начинки. После принятия решения может быть взят образец для анализа с помощью соответствующего асептического метода и стерильных средств отбора проб [76]. После разработки процедуры отбора проб мик­робиолог может быть уверен, что взятые пробы являются представительными проба­ми проверяемого продукта, а методам проверки можно доверять.

 Традиционные микробиологические методы

Как показано во введении к данной главе, традиционные микробиологические мето­дики основаны на общепризнанном методе: пробы пищевого продукта помещают в пи­тательную среду и в течение некоторого времени выдерживают там для роста микро­организмов. Определение микроорганизмов или их подсчет затем осуществляют путем обычной визуальной оценки роста культуры. Эти методы технически просты и относительно дешевы, поскольку не требуют сложного оборудования. При этом они легко могут быть приспособлены для определения количества микроорганизмов раз­личных групп.

Перед тестированием образцы пищевого продукта должны быть переведены в жид­кую форму, чтобы их можно было смешать со средой для выращивания. Это обычно делается так: пробу точно отвешивают в стерильный сосуд и добавляют известный объем стерильного растворителя (соотношение пробы к растворителю обычно состав­ляет 1:10); затем полученную смесь гомогенизируют с помощью гомогенизатора, ко­торый дробит пробу, и при этом все микроорганизмы попадают в раствор. Здесь важен правильный выбор растворителя — если на микроорганизмы в пробе отрицательно действуют неправильно выбранное значение pH или низкое осмотическое давление, они могут оказаться поврежденными или погибнуть, что повлияет на конечный ре­зультат микробиологического теста. Растворитель должен быть хорошо буферирован при pH, соответствующем тестируемому продукту, и быть осмотически уравновешен. При тестировании некоторых продуктов (например, сушеных), которые могут содер­жать микроорганизмы, подвергшиеся сильному отрицательному воздействию перед началом теста, может потребоваться определенный период для их восстановления, что­бы клетки не погибли в его начальной фазе [39].

Традиционные количественные методы

Подсчет количества микроорганизмов в пробах обычно производится методом под­счета на пластинке или методом наиболее вероятного числа (MPN). Наиболее широ­ко применяется первый из этих методов, а второй обычно используется лишь для определенных микроорганизмов (например, Escherichia coli) или их групп (напри­мер, колиформ).

Метод подсчета на пластинке

Метод подсчета на пластинке основан на помещении пробы в слой агара в чашке Петри или на него. Отдельные микроорганизмы или небольшие их группы занимают в агаре отдельное место, и после инкубации вырастают, образуя отдельные колонии, количе­ство которых подсчитывают визуально. Для подсчета количества различных видов микроорганизмов можно использовать различные виды агаровой среды. Использова­ние неселективной питательной среды, которая выдерживается при 30 °С в аэробных условиях, даст общий счет жизнеспособных микроорганизмов, или мезофильный аэробный счет. Изменяя условия инкубации на анаэробные, получают общий анаэроб­ный счет. Изменение температуры приведет к изменениям типов микроорганизмов, способных к росту, демонстрируя некоторую гибкость традиционного подхода с при­менением агара. Если присутствует требование определить в пробе количество микро­организмов определенного типа, то чтобы сделать возможным рост только нужного типа микроорганизмов, в большинстве случаев необходимо изменить состав среды. Существует три подхода к созданию среды, позволяющих создать специальные среды: элективные, селективные и дифференциальные процедуры.

Элективные процедуры — это такие, при которых в среду включают реагенты или используют условия роста, способствующие развитию определяемых микроорганиз­мов, но не подавляющие рост других. Такими реагентами могут служить сахара, ами­нокислоты или другие факторы роста. К селективным процедурам относят процедуры включения реагентов или использование условий роста, подавляющих развитие микроорганизмов, отличных от определяемых. Следует отметить, что во многих слу­чаях селективные факторы будут также отрицательно влиять на рост определяемых микроорганизмов, но это влияние будет меньше их влияния на другие клетки. Приме­рами селективных процедур являются введение в среду антибиотиков или использо­вание анаэробных условий роста. Наконец, дифференциальные процедуры позволяют различить микроорганизмы по тем реакциям, которые их колонии вызывают в среде. Примером может служить введение в среду индикатора pH, чтобы отличить микро­организмы, образующие кислоту. В большинстве случаев среда будет использовать систему с комплексным подходом, содержащую элективные, селективные и диффе­ренциальные компоненты, чтобы пользователь мог идентифицировать и подсчитать определяемый микроорганизм.

Количество доступных в настоящее время типов агара слишком велико, чтобы даже просто их перечислить. Их характеристики следует искать в справочных руководствах фирм, выпускающих эти среды (например, Oxoid, LabM, Difco, Merck).

Метод MPN

Вторая из упомянутых выше процедур подсчета — это метод MPN, который позволяет оценить количество жизнеспособных микроорганизмов в пробе на основе статисти­ческого метода. Оценку получают, готовя десятикратные разбавления пробы и перено­ся полученные пробы каждого разбавления в три (обычно) пробирки питательной среды. Эти пробирки выдерживают, и те, в которых наблюдается какой-либо рост (помутнение), фиксируют и сравнивают со стандартной таблицей результатов [2], в которой указан уровень заражения продукта.

Этот метод используют только для некоторых видов тестов, так как он более трудо­емок и требует больше материалов, чем метод подсчета на пластинке. Кроме того, гра­ницы доверительного интервала велики, и таким образом, этот метод обычно менее точен, чем метод подсчета на пластинке.

Традиционные качественные методы

Качественные процедуры используются тогда, когда знать количество микроорганиз­мов в пробе не требуется, а требуется лишь выяснить, присутствуют они или отсут­ствуют. Обычно такие методы используются для определения потенциально патоген­ных микроорганизмов, таких как Salmonella, Listeria, Yersinia и Campylobacter. Для выполнения анализа необходимо гомогенизировать точно взвешенную пробу (обычно 25 г) в первичном питательном бульоне и выдержать в течение заданного времени при заданной температуре. В некоторых случаях проба после первичного бульона может требовать переноса во вторичный питательный бульон и дополнительной выдержки (инкубации). Полученный продукт обычно наносят на селективную агаровую плас­тинку, на которой возможен рост определяемого микроорганизма. Длительная про­цедура выращивания используется потому, что проба может содержать очень мало определяемых микроорганизмов и большое количество «фоновых». Кроме того, в обработанных продуктах определяемые микроорганизмы могут находиться в повреж­денном состоянии, и поэтому методы выращивания делают возможным восстановле­ние поврежденных клеток и их последующее избирательное выращивание в присут­ствии большого числа конкурирующих микроорганизмов.

Определяемый микроорганизм в бульонной культуре обычно незаметен, поэтому бульон необходимо наносить на селективную/дифференциальную агаровую пластин­ку. Затем микроорганизмы можно обнаружить по появлению их колоний. Образова­ние типичных для определемых микроорганизмов колоний на агаре описывается как предполагаемые колонии. Для подтверждения того, что эти колонии состоят из опре­деляемых микроорганизмов, обычно проводят дополнительные биохимические и се­рологические определения на чистых культурах микроорганизма. Это обычно требует, чтобы для обеспечения чистоты колонии с пластинок первичного выделения были вновь перенесены. Очищенные колонии затем проверяют биохимически, выращивая их в среде, которая показывает, производит ли микроорганизм определенные фермен­ты или использует ли определенные сахара.

В настоящее время ряд фирм продает миниатюрные системы для биохимического тестирования, позволяющие микробиологам быстро и просто выполнять биохимиче­ские экспресс-определения или автоматические тесты. Серологические тесты выпол­няются на чистых культурах некоторых выделенных микроорганизмов (например, Salmonella) с использованием промышленно выпускаемых антисывороток.

Экспресс-методы и автоматические методы

Общий интерес к новым микробиологическим методам частично определяется воз­росшим объемом производства пищевых продуктов. Это приводит к:

•  увеличению объема хранящихся проб до получения положительного результата (снижение времени анализа снизило бы складские издержки);
•  увеличению количества анализируемых в лаборатории проб (единственная воз­можность их обработки — это увеличение размеров лабораторий и их штата, а также применение более ускоренных автоматизированных методов);
•  более продолжительному сроку хранения охлажденных продуктов (сокращение времени анализа могло бы ускорить выпуск продукции и тем самым увеличить срок хранения продукта);
•  росту применения процедур НАССР (экспресс-методы могут применяться в про­цедурах проверки качества по методу НАССР).

Существует несколько методов, носящих название «экспресс-методов», причем большинство из них сильно отличаются как друг от друга, так и от традиционных про­цедур, которые они заменяют. Эти методы можно разделить на количественные и каче­ственные тесты, причем первые дают значение количества микроорганизмов в пробе, а вторые указывают лишь на их присутствие или отсутствие. В лабораториях, где рас­сматривается вопрос использования экспресс-методов для стандартных (рутинных) испытаний, следует тщательно определить свои требования перед покупкой той или иной системы ускоренного анализа. Каждый новый метод уникален и дает несколько отличный от других результат, у него определенные временные характеристики, уро­вень автоматизации и производительность. Кроме того, некоторые методы плохо ра­ботают с определенными видами продуктов или не могут выявить определенные мик­роорганизмы или группы, которые требуется определять. Все эти моменты необходи­мо учитывать перед принятием решения о включении того или иного метода в арсенал лаборатории. Важно также, чтобы персонал, использующий новые методы, понимал принципы, которые лежат в их основе, а значит, при явно неверных результатах мог бы обнаружить причину их получения.

Электрические методы

Определение количества микроорганизмов в растворе может быть достигнуто двумя электрическими методами, один из которых определяет количество и размер частиц, а другой контролирует их метаболическую активность.

Подсчет частиц

Подсчет и определение размера частиц могут быть выполнены на основе принципа «Coulter» с использованием счетчика Coulter Counter (компании Coulter Electrics, г. Лу­тон, Великобритания). Метод основан на пропускании электрического тока между двумя электродами, помещенными по сторонам перегородки с небольшим отверстием. Когда частицы или клетки, взвешенные в электролите, проходят через отверстие, они вытесняют объем электролита, равный им по объему, вызывая падение электропро­водности по постоянному току, которое зависит от размера клетки. Эти изменения в проводимости определяются прибором и могут быть преобразованы в последователь­ность импульсов напряжения, причем амплитуда каждого импульса пропорциональна объему частицы, а количество импульсов соответствует количеству частиц.

Этот метод широко используется в исследовательских лабораториях для экспе­риментов, требующих определения размера клеток или их распределения, а также применение в клинической микробиологии, где требуется определение бактерий [1]. В пищевой микробиологии этот метод, однако, до сих применялся мало. Имеются отчеты по определению количества клеток в молоке [49] и определению дрожжей в пиве [83], но о других исследованиях информации явно недостаточно. Любое приме­нение подсчета частиц в пищевой микробиологии было бы, вероятно, ограничено невязкими жидкими пробами или жидкостями, свободными от взвешенных частиц, так как очень малое количество пробы может вызвать значительные искажения ре­зультатов и засорение отверстия.

Метаболическая активность

В работе [123] впервые было сообщено об использовании электрических измерений для контроля роста микроорганизмов. Автор использовал измерения проводимости для контроля разложения крови, и пришел к заключению, что электрические измене­ния вызывали ионы, образованные при бактериальном разложении составляющих кро­ви. После этого первого отчета применение электрических измерений для контроля роста микроорганизмов изучалось рядом исследователей, и их работа в основном была успешной. Тем не менее этот метод не получил широкого распространения до тех пор, пока не стали доступны надежные приборы, способные контролировать электрические изменения в культурах микроорганизмов.

В настоящее время выпускается четыре прибора для определения микроорганиз­мов с помощью электрических измерений. Система Malthus System (IDG, г. Бэри, Ве­ликобритания), основанная на работе [105], контролирует изменения проводимости, происходящие в среде для выращивания, аналогично системе Rabit System {Don Whitley Scientific, Йоркшир). Устройства Bactometer(bioMerieux, г. Бэйзингсток, Великобри­тания) и Batrac (SyLab, г. Пуркерсдорф, Австрия) [6] могут контролировать как ак­тивную проводимость, так и емкостное сопротивление. Все эти приборы имеют одина­ковые основные компоненты:

а)инкубаторную систему для хранения проб при постоянной температуре в ходе испытания;

б) контрольный блок, измеряющий активную проводимость и/или емкостное со­противление каждой ячейки через регулярные интервалы (обычно каждые 6 мин);

в) компьютерную систему обработки данных, представляющую результаты в удоб­ном для использования формате.

Определение роста микроорганизмов с помощью электрических систем основано на измерении ионных изменений, происходящих в среде из-за метаболизма микро­организмов. Изменения, вызванные метаболизмом микроорганизмов, и электрохи­мические процессы, используемые в этих системах, довольно детально описаны в литературе [23, 45, 46]. Принцип заключается в том, что при росте и метаболизме бактерий проводимость среды возрастает. Электрические изменения, вызываемые малым количеством бактерий, невозможно определить, используя выпускаемые в настоящее время приборы. Чтобы изменения можно было зарегистрировать, в 1 мл должно присутствовать примерно 106 микроорганизмов. Это величина известна как предел обнаружения, а время, необходимое для достижения этого момента, называет­ся временем обнаружения.

При использовании электрических систем для определения числа микроорганиз­мов в пищевых продуктах проба должна быть сначала гомогенизирована. Гомогенизи­рованную пробу помещают в находящуюся в приборе ячейку или пробирку со средой для выращивания и подключают к ней контрольный блок инкубационной камеры или термостата. Электрические свойства среды для выращивания записываются в течение периода инкубации. Сосуд с пробой — это обычно стеклянная или пластмассовая про­бирка или ячейка, в которые помещены два электрода. Пробирку наполняют подходя­щей средой для выращивания микроорганизмов и добавляют в нее гомогенизирован­ную пробу пищевого продукта. Электрические изменения, происходящие в среде для выращивания при метаболизме микроорганизмов, контролируются с помощью элект­родов и регистрируются прибором.

При росте и в ходе метаболизма микроорганизмов в среде образуются новые ве­щества. Обычно незаряженные или слабозаряженные субстраты превращаются в сильно заряженные конечные продукты [44], увеличивая активную проводимость среды. Рост некоторых микроорганизмов (например, дрожжей) не приводит к зна­чительному росту проводимости, что, вероятно, связано с тем, что эти микроорга­низмы не производят ионизированных метаболитов, а это может вести к снижению проводимости при росте.

При использовании прибора для измерения импеданса электрическое сопротивле­ние среды для выращивания записывается автоматически в течение инкубационного периода через регулярные интервалы (например, через 6 мин). Когда обнаруживается изменение контролируемого электрического параметра, истекшее время с начала ис­пытания вычисляется компьютером и обычно отображается как время обнаружения. Полная кривая изменений электрического параметра во времени (см. рис. 8.1) по­добна кривой бактериального роста, которая имеет сигмоидальную форму с тремя участками:

а)неактивная область, где все электрические изменения лежат ниже порога обна­ружения прибора;

б)активная область, где происходят быстрые электрические изменения и

в)стационарная область или область спада, расположенная непосредственно после активной области и указывающая на замедление электрических изменений.

Не следует рассматривать кривую электрического отклика как подобие кривой роста микроорганизмов. Считается [45], что лаг-фаза и логарифмическая фаза роста микроорганизмов приходятся на неактивную и активную области кривой электриче­ского отклика, до порога обнаружения прибора и за ним. Логарифмическая и стацио­нарная фазы бактериального роста соответствует активной области и области спада кривых электрического отклика.

При использовании данных о времени обнаружения, полученных с помощью элек­трических приборов, для оценки микробиологического качества пробы продукта не­обходимо выполнить калибровку. Калибровка заключается в тестировании проб с помощью традиционного теста с пластинками и электрического теста. Результаты представляются графически, причем традиционный результат — на оси у, а время обна­ружения — на оси х (см. рис. 8.2). В результате получается отрицательная кривая с

Рис. 8.1. Кривая активной проводимости, полученная при росте бактерий в благоприятной среде

Рис. 8.2. Калибровочная кривая, показывающая изменения времени обнаружения по проводимости и общее количество жизнеспособных микроорганизмов

данными, охватывающими 4-5 логарифмических циклов микроорганизмов при ко­эффициенте корреляции более 0,85 [45]. Калибровки должны быть выполнены для каждого вида пробы, тестируемого с помощью электрических методов; различные про­бы будут содержать разные виды микрофлоры с различными скоростями роста. Если калибровка выполнена неправильно, то это может существенно повлиять на время об­наружения и привести к неверным результатам.

До сих пор мы рассматривали применение электрических приборов для оценки общей численности микроорганизмов. Эти системы, однако, основаны на использова­нии среды для выращивания, и поэтому позволяют с помощью специально подобран­ных сред разработать методы оценки численности или обнаружения определенных микроорганизмов или их групп. Существует достаточно работ, посвященных электри­ческим измерениям для выявления/определения количества конкретных микроорга­низмов. Так, Enterobacteriaceae посвящены работы [34,95], Pseudomonas — [7], Yersinia enterocolitica — [132], дрожжам — [31], E.coli — [42], a Campylobacter — [24].

В будущем количество видов определяемых микроорганизмов, несомненно, увели­чится. В настоящее время проводится большой объем исследований по средам для опре­деления Listeria, после чего начнут появляться среды для других микроорганизмов.

Большинство описанных выше эклектических методов основаны на использовании контактного измерения, то есть электрические изменения контролируются с помощью электродов, погруженных в среду культивирования. Некоторые авторы [93] указыва­ли на потенциальные возможности бесконтактной кондуктометрии для определения микроорганизмов. При этом среда для выращивания расположена в одном отсеке ячей­ки, а электрод в другом. Жидкость, окружающая электрод, поглощает газ (например, для углекислого газа — это гидроксид калия). В среду для выращивания помещается

проба, и при росте микроорганизмов выделяется газ. Этот газ абсорбируется жидко­стью, окружающей электрод, что вызывает изменение проводимости, которое можно обнаружить.

Этот метод позволяет решить проблему микроорганизмов, вызывающих лишь не­большое изменение проводимости в традиционных ячейках для контактной кондуктометрии. Такие микроорганизмы (например, многие виды дрожжей) очень трудно об­наружить традиционными методами прямой кондуктометрии, но при использовании бесконтактного кондуктометрического контроля определение становится довольно простым [10]. Развитие косвенных методов в будущем могло бы значительно улуч­шить способность электрических систем обнаруживать микроорганизмы, вызываю­щие небольшие электрические изменения в контактных системах, способствуя приме­нению данного метода в пищевой промышленности.